הדמיה של תאי בטא טרנסגניים בעכבר מדוכא חיסון המאותגר בטחול סוכרתי

תקציר

מקור: Stewart, T. et al., Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice.J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים שיטה מבוססת הדמיה לדמיין תאי בטא מושתלים המבטאים לוציפראז בעכבר שאינו סובל מהשמנת יתר. הכנסת טחול מעכבר סוכרתי מובילה להרס מתקדם של תאי בטא, המאושר חזותית על ידי ירידה בעוצמת האור לאחר החדרת המצע.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הנדסה ותחזוקה של קווי תאים NIT-1

1. שמרו על קווי תאים מסוג NIT-1, החולקים רקע גנטי עם עכברי סוכרת שאינם שמנים (NOD), ותאי 293FT בכלים שטופלו בתרבית רקמות במדיום הנשר המעובד (DMEM) של דולבקו המכיל 4.5 גרם/ליטר גלוקוז בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
2. להגדיל את התאים 293FT למפגש 70%-80% עבור transfection.
3. לכל צלחת של 10 ס"מ של תאי 293FT, ערבבו 10 מיקרוגרם של pLenti-luciferase-blast (ראה קובץ משלים 1), המבטא את טרנסגן הגחלילית luciferase (luc2) תחת שליטת פרומוטור EF1α הפעיל באופן קונסטיטוטיבי, 2 מיקרוגרם כל אחד מפלסמידים האריזה pMD2.G, pMDLg/pRRE ו-pRSV-Rev, 4 מיקרוגרם של פלסמיד חלבון המעטפת pCMV-VSV-G, ו-60 מיקרוגרם של פוליאתילנימין ליניארי (PEI) ב-1 מ"ל של DMEM ללא סרום. התאם את הכמויות בהתבסס על מספר התאים שיש להדביק.
4. השאירו את הדנ"א, ה-PEI וה-DMEM בטמפרטורת החדר (RT) למשך 20 דקות, ולאחר מכן הוסיפו אותם לתאי 293FT.
5. לאסוף את המדיום המכיל את החלקיקים lentiviral 48 שעות לאחר transfection.
6. התמירו את תאי NIT-1 במפגש ~80% עם 1 מ"ל של חלקיקים לנטי-ויראליים המכילים תווך לכל 10⁶ תאים למשך 48-72 שעות.
7. בחר את התאים המבטאים luciferase עם 5 מיקרוגרם / מ"ל blasticidin במשך 48 שעות.
8. יתר על כן, לשנות גנטית את התאים המבטאים luciferase כדי להתאים את השאלה הניסויית. כלול קו תאי בקרה מסוג פרא המבטא לוציפראז או שאינו ממוקד לצורך השוואה.
   הערה: דוגמאות לשינויים בגני מטרה כוללות נוקאאוט של חזרות פלינדרומיות קצרות במרווחים קבועים (CRISPR), CRISPRa/i, shRNA knockdown וביטוי יתר.

2. הכנת תאי NIT-1 להשתלה

1. לגדל את התאים המבטאים luciferase עד שהם 80%-90% confluent.
2. מוציאים את מצע הגידול ושוטפים את התאים במי מלח חוצצים פוספט (PBS, 5 מ"ל לצלחת של 10 ס"מ).
3. הוסיפו 1 מ"ל של 0.05% חומצה טריפסין-אתילאנדיאמיןטטראצטית (טריפסין-EDTA) לכל מנה למשך 2 דקות.
4. לנטרל את טריפסין עם 5 מ"ל של מדיום צמיחה.
5. השתמש פיפטה כדי לשטוף את התאים מן הצלחת ולהעביר אותם צינור חרוט.
   הערה: ניתן לשלב תאים ממספר מנות של אותו קו תא.
6. ספור את התאים באמצעות כתם כגון כחול טריפאן באופן ידני עם hemocytometer או באופן אוטומטי עם מונה תאים אוטומטי.
7. צנטריפוגה ב 250 × גרם במשך 5 דקות ב RT ולהסיר את supernatant עם פיפטה שאיפה.
8. להשהות מחדש את גלולת התא ב- PBS בריכוז של 5 × 10⁷ תאים / מ"ל (10⁷ תאים לכל קו תא לכל עכבר יושתלו בנפח של 200 μL).
9. שמור את התאים על קרח (עד 3 שעות) עד ההשתלה.

3. השתלת תאי NIT-1 בעכברים שאינם שמנים עם כשל חיסוני משולב (NOD-scid)

1. מרדימים את העכברים המקבלים (עכברי NOD-scid בני 8-10 שבועות מאותו המין כמו העכברים המשמשים לבידוד הטחול) על ידי שאיפת איזופלורן בתא הפלה. לספק 2.5% איזופלורן לתוך התא בקצב זרימה של 1.5 ליטר לדקה וקצב פינוי של 9 ליטר לדקה.
2. לשמן את העיניים של החיה עם משחה אופתלמית כדי למנוע התייבשות.
3. בעזרת מכונת גילוח חשמלית עם מגן, הסירו את השיער מהגב (הצד הגבי) של העכברים כדי לחשוף את העור. שטח ההשתלה המגולח יהיה בערך 1 ל x 2 אינץ '. מחזירים את העכברים המגולחים לתא ההפלה עד להשתלה.
4. מעבירים את העכברים אחד בכל פעם למשטח נקי עם חרוט אף איזופלורן. כוונו בעדינות את ראש העכבר לתוך חרוט האף. השתמש בקצב זרימת איזופלורן של 0.25 ליטר לדקה כדי לשמור על ההרדמה במהלך ההשתלה.
5. נגבו את אזור ההשתלה עם פד להכנת אלכוהול איזופרופיל כדי להסיר שיער רפוי ולחטא את העור.
6. ודא שהתאים מושהים מחדש במלואם לפני טעינת המזרק. צייר נפח עודף (>300 μL) של תאים לתוך מזרק סטרילי 1 מ"ל עם מחט 26 גרם. הסר בועות; לאחר מכן להחזיר תאים עודפים לצינור, כך 300 μL של השעיית התא נשאר מזרק.
7. בעזרת זוג מלקחיים מעוקלים המוחזקים ביד הלא דומיננטית, הרימו בעדינות את העור בצד אחד (שמאל או ימין) של גב העכבר כדי לאפשר גישה קלה יותר לחלל התת עורי.
8. בעזרת היד הדומיננטית, מקמו את המזרק במקביל למישור העטרה והקשת בגוף העכבר. כאשר המחט מכוונת לכיוון ראש העכבר, הכנס את המחט לעור ליד החלק האחורי והנחה אותה בעדינות לתוך החלל התת עורי. ודא כי המחט כולה נשארת מתחת לעור ולא לחטט דרכה.
9. התאימו את המלקחיים כך שיחזיקו בעדינות את העור סביב בסיס המחט. שחררו באיטיות כמות קטנה של תרחיף תאים (<50 μL) ואשרו כי בליטה קטנה נוצרת מתחת לעור במקום ההזרקה. המשך הזרקת תרחיף התא עד 200 μL מועבר לחלל תת עורי.
10. מחזיקים את המלקחיים במקום ושומרים על המחט מקבילה לגוף העכבר, מושכים לאט את המחט. לאחר הסרת המחט, החזיקו את העור סגור במלקחיים למשך מספר שניות כדי למנוע מהתאים לדלוף החוצה מפצע הניקוב.
11. אם נבדק שינוי גנטי, חזור על ההשתלה בצד הנגדי של העכבר באמצעות מזרק אחר, כך שגם תאי מוטציה וגם תאי ביקורת מוזרקים לכל עכבר, כאשר קו תא אחד משמאל והשני מימין. אם מושתל רק קו תאים אחד, הזריקו את התאים בצד אחד בלבד.
12. לאחר ההשתלה מעבירים כל עכבר לכלוב טרי. אפשר לכל עכבר להתאושש לחלוטין מההרדמה לפני הוספת עכברים נוספים לכלוב.
    הערה: עכברים מתאוששים כאשר הם חוזרים לפעילות רגילה ואינם מראים סימני עייפות או תנועה לקויה.
13. להעריך את מצב הבריאות של העכברים מדי יום במשך הניסוי לאחר ההשתלה. אם השתלים יוצרים בליטה גדולה או שהעכברים נעשים חלשים ורדומים, מדדו את רמת הגלוקוז בדמם וספקו 10% (w/w) מי סוכרוז לכל העכברים הסובלים מהיפוגליקמיה. יש לעקוב אחר כל ההמלצות הווטרינריות ולהרדים עכברים הסובלים מהמשך מצב גוף ירוד בהתאם להנחיות המוסדיות. במחקר זה, עכברים הומתו על ידי שאיפת_CO2 ואחריה נקע צוואר הרחם.

4. בידוד וטיהור של splenocytes autoreactive

1. זהה עכברי NOD זכר או נקבה בני 10-16 שבועות עם סוכרת לאחרונה (פחות מ -10 ימים) באמצעות רצועות בדיקת גלוקוז בשתן (או בדם). עכברי NOD נחשבים לסוכרתיים כאשר יש להם שתן / גלוקוז בדם ≥250 מ"ג / ד"ל לפחות יומיים רצופים.
   הערה: עבור כל עכבר NOD-scid, 10 מיליון splenocytes נדרשים; טחול אחד מניב בדרך כלל 50 מיליון עד 150 מיליון טחול. הטחול בודד מעכברים נטולי פתוגן ששוכנו במתקן מנוטר זקיף.
2. להרדים את המספר המתאים של עכברי NOD סוכרתיים.
   הערה: במחקר זה, העכברים הומתו על ידי שאיפת_CO2 ואחריה נקע צוואר הרחם כדי להבטיח מוות.
3. עם העכבר על גבו, בצע חתך אנכי באורך של כ -2 אינץ 'בעור עם מספריים כירורגיים. פתח את הצד הימני של העכבר מנקודת מבטו של החוקר ואתר את הטחול האדום הבוהק. חותכים בעדינות את הטחול מהלבלב הוורוד ומעבירים אותו לצלחת פטרי סטרילית בקוטר 10 ס"מ המכילה 5 מ"ל PBS סטרילי. חזור על הדיסקציה עם עכברים רבים ככל שיידרש.
   הערה: טחול ממספר עכברים יכול להיות משולב בצלחת אחת. בצע את השלבים הבאים באמצעות ריאגנטים סטריליים וציוד במכסה מנוע סטרילי.
4. מועכים את הטחול עם החלק העליון השטוח של בוכנה מזרק סטרילי.
5. הניחו מסננת של 40 מיקרומטר או 70 מיקרומטר בצינור חרוטי של 50 מ"ל ושטפו את המסננת עם 5 מ"ל PBS כדי להקדים אותה. מעבירים את מתלה הטחול לתוך המסננת וממשיכים למעוך עדין דרך המסננת. לשטוף את המנה עם 10 מ"ל של PBS ולהעביר את הכביסה למסננת. ממשיכים למעוך עד שהצבע האדום נעלם מהמסננת.
6. השליכו את המסננת וסובבו את הצינור ב-500 × גרם למשך 5 דקות ב-RT. הסירו את הסופרנאטנט עם פיפטה שואפת.
7. השהה מחדש את גלולת התא ב -5 מ"ל (עד שלושה טחול) של חיץ ליזה ACK שחומם מראש ל- RT וליזה את תאי הדם האדומים למשך 4 דקות. הגדל את נפח הטחול ב 1-2 מ"ל לטחול אם יש צורך בטחול נוסף.
8. עצור את התגובה עם 5 מ"ל של מדיה סלולרית NIT-1 (המתוארת לעיל) לכל 5 מ"ל של חיץ ליזיס. העבירו את מתלה התא דרך מסננת טרייה כדי להסיר גושים. השליכו את המסננת וסובבו ב-500 × גרם במשך 5 דקות ב-RT.
9. להשעות מחדש את גלולת התא ב 20 מ"ל של PBS, ולספור את התאים. סחרור ב- 500 × גרם למשך 5 דקות ב- RT. השהה מחדש את התאים ב- PBS סטרילי בריכוז של 1 × 10⁸ תאים/מ"ל (נפח ההזרקה הוא 0.1 מ"ל / עכבר) בצינור תגובה לנעילה בטוחה של 1.5 מ"ל
.
10. אחסנו את התאים על קרח (לא יותר משעה אחת) או שמרו את התאים ב-RT, והמשיכו מיד להזרקת וריד הזנב
.

5. הזרקה תוך ורידית של טחול סוכרתי דרך וריד הזנב הלטרלי

1. לחמם את הגוף של עכברי NOD-scid הבוגרים (למשל, באמצעות מנורת חום במשך ~ 5-10 דקות) כדי להרחיב את הוורידים (זה עוזר הדמיה והזרקה לתוך הווריד).
   הערה: כדי למנוע התחממות יתר של העכברים, לא לחרוג הפעם. עקוב תמיד אחר מצב הבריאות. אם העכברים נראים מותשים או חסרי תנועה, כבו מיד את מנורת החום.
2. חממו את מתלה התא. הכינו מזרק סטרילי (0.3-1.0 מ"ל) עם מחט סטרילית (27-30 גרם, 0.3 מ"מ / 0.5 אינץ' או פחות), או השתמשו במזרק אינסולין סטרילי של 0.5 מ"ל עם מחט 0.3 מ"מ (0.5 אינץ'). הקפידו תמיד לשמור על המחט סטרילית ולהשתמש במגש סטרילי אם יש להניח את המזרק בין הזרקות.
3. השהה מחדש את תמיסת הטחול לפני כל הזרקה. עבור כל עכבר, צייר 100 μL של תרחיף הטחול שחומם מראש ומעורב לתוך המזרק. ודא שאין בועות אוויר במזרק או בתרחיף.
   הערה: יש להקפיד להכין את כל הציוד והציוד (מגבוני אלכוהול לחיטוי, מזרק עמוס בטחול להזרקה וכלוב טרי להפרדת עכברים מוזרקים) לפני הכנסת העכבר למכשיר הריסון.
4. מקם את העכבר בהתקן הריסון. לכדו את הזנב ביד הלא דומיננטית ואתרו את אחד משני ורידי הזנב הרוחביים. סובבו את הזנב בעדינות במידת הצורך. נגבו את הזנב במגבון חיטוי (70% אלכוהול איזופרופיל) כדי לנקות את העור ולהגביר את הנראות של הווריד.
5. הכנס את המחט בזווית חדה לאזור המרכזי של הזנב עם היד הדומיננטית. כאשר שיפוע המחט פונה כלפי מעלה, החלק את המחט כמה מילימטרים דרך העור.
   הערה: ודא שהמחט מקבילה לווריד וממוקמת מעט מתחת לעור. היו מוכנים לתנועות פתאומיות של העכבר/זנב מיד לאחר החדירה לדופן העור/כלי הדם. החדרה מוצלחת של המחט צריכה להרגיש כמו "החלקה חלקה" לתוך הווריד. אם יש צורך בניסיון נוסף, התקדם הלאה במעלה הזנב לכיוון הגוף.
6. הפעל לחץ עדין על המזרק כדי להזריק את מתלה הטחול. אין לאפשר למחט לנוע פנימה או החוצה בעת ההזרקה. זריקות מוצלחות הן חלקות ללא תחושת לחץ גב במהלך ההזרקה ומסומנות על ידי זרימת דם שקופה/לבנה מיד לאחר ההזרקה.
7. שחררו בעדינות את המחט מהווריד והפעילו לחץ קל על הזנב עם מגבון חיטוי עד שהדימום ייפסק. שחררו את העכבר מהתקן הריסון והעבירו אותו בעדינות לכלוב שזה עתה הוכן מראש.
   הערה: הזריקו שניים עד שלושה עכברי ביקורת שאינם מקבלים השתלת תאי NIT-1 עם טחול כדי לאשר את הפוטנציאל של הטחול האוטוריאקטיבי לגרום לסוכרת, דבר שלוקח בערך 2-4 שבועות לאחר ההזרקה.

6. הדמיה ביולומינסנטית In vivo של שתלי NIT-1

הערה: צלם את השתלים פעם עד פעמיים בשבוע. ביום ההשתלה, המתן לפחות שעתיים לאחר ההשתלה כדי לאפשר לשתלים להתיישב ולהבטיח ביטוי יציב של לוציפראז. אם הזמן הוא גורם מגביל, ניתן לבצע את המדידה הראשונית ביום הראשון במקום. לוח זמנים מומלץ להדמיה ראשונית הוא יום 0 או יום 1 לאחר ההזרקה, יום 5, יום 10, יום 14, יום 18 ויום 25. התאם את לוח הזמנים, עם זאת, בהתבסס על התקדמות אוטואימוניות כפי שנשפט על ידי אובדן אות bioluminescent.

1. הכינו תמיסת D-luciferin במינון 15 מ"ג/מ"ל ב-PBS של Dulbecco. יש להתסיס ב-RT כדי להתמוסס, ולסנן סטרילי (0.22 מיקרומטר). יש לאחסן 1 מ"ל aliquots ב -20 ° C, ולהפשיר לפי הצורך.
   הערה: את aliquots ניתן להקפיא מחדש.
2. לפחות 5 דקות לפני ההדמיה, הזריקו את העכברים תוך צפקית באמצעות מזרק 1 מ"ל ומחט 26 גרם עם תמיסת D-luciferin במינון של 150 מ"ג / ק"ג.
   הערה: השתמש מזרק ומחט טריים עבור כל עכבר.
3. מרדימים את העכברים בשאיפת איזופלורן בהתאם להנחיות המוסדיות. התנאים המומלצים הם 2.5% איזופלורן עם קצב זרימה של 1.5 ליטר/דקה לתוך תא ההפלה, וקצב פינוי של 9 ליטר/דקה.
4. לשמן את העיניים של החיה עם משחה אופתלמית כדי למנוע התייבשות.
5. פתח את התוכנה המשויכת למכשיר ההדמיה. צור משתמש חדש ו/או התחבר. בלוח הבקרה בפינה השמאלית התחתונה, בחר Initialize (איור 1A). כדי לשמור באופן אוטומטי את נתוני ההדמיה, צור את התיקיות המתאימות במחשב ולאחר מכן בחר רכישה | שמירה אוטומטית ל... (איור 1A). לאחר סיום אתחול המכשיר, הגדר את זמן החשיפה לדקה אחת
   הערה: פרמטרי ההדמיה המלאים מוצגים באיור 1B.
6. העבירו את העכברים בזה אחר זה מתא ההפלה למכשיר ההדמיה. הניחו את העכבר על בטנו כשגפיו משורבבות, וכיוונו בעדינות את ראשו לתוך חרוט האף. קצב זרימה איזופלורני של 0.25 ליטר/דקה המועבר דרך חרוט אף מתאים לשמירה על הרדמה במהלך ההדמיה. שטח את העכבר בעדינות על ידי לחיצה על מרכז גבו בשתי ידיו ולאחר מכן פיזר את הידיים החוצה ובנפרד.
7. בחר רכוש (איור 1B). תיעדו את כל הפרטים הרלוונטיים של הניסוי בחלון המוקפץ (איור 1C).
   הערה: ראו איור 2A לתמונות מייצגות של שלוש נקבות עכברי NOD-scid בנות 8 שבועות שהושתלו עם שני שתלים בנקודות זמן שונות.

תוצאות

איור 1: צילומי מסך של פקודות התוכנה עבור הדמיה של שתלים ביולומינסנטיים. (A) לפני ההדמיה, בחר Initialize כדי להכין את המכשיר. ניתן לשמור את התמונות באופן אוטומטי בתיקיה לפי בחירה על-ידי בחירה באפשרות רכישה | שמירה אוטומטית ל... (B) סקירה כללית של פרמטרי ההדמיה. לאחר מיקום העכבר במכשיר, בחר רכישה. (

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.05% טריפסין, 0.53 mM EDTA	קורנינג	25-052-CI
293FT	Invitrogen	₪17007	מבודד שבטי בעל יכולת העברה גבוהה הגדל במהירות ומופק מתאי כליה עובריים אנושיים שעבר טרנספורמציה עם אנטיגן T גדול SV40
ACK Lysing Buffer	גיבקו	A10492-01
תחבושות להכנת אלכוהול, 70% אלכוהול איזופרופיל	עזרה ראשונה של Amazon/Ever Ready	B08NWF31DX
BD 5ml מזרק Luer-Lok טיפ	ב.ד.	309646
מחט BD PrecisionGlide 26G x 5/8 (0.45 מ"מ x 16 מ"מ) Sub-Q	ב.ד.	305115
BD 1 מ"ל TB קצה מזרק להחליק	ב.ד.	309659
Blasticidin S HCl	קורנינג	30-100-RB
מסננת תאים באיכות פרימיום SureStrain, 70 מיקרומטר, סטרילית	סאות'רן לבוור	C4070	או להשתמש מסננת סטרילית דומה עם גודל נקבוביות 40-70um
מונה תאים אוטומטי CellDrop	דנוביקס	CellDrop BF-PAYG	לחלופין, השתמש בהתקן מונה תאים דומה
קורנינג 100 מ"ל תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, 100x	קורנינג	30-002-CI
Pipets שאיפה חד פעמי, פוליסטירן, סטרילי, קיבולת=2 מ"ל	VWR	414004-265	או להשתמש פיפטה שואפת דומה
D-Luciferin, מלח אשלגן, כיתה ביולוגיה מולקולרית, אבקה, >99%	גולדביו	מזל-100
DMEM, גלוקוז גבוה, פירובט, ללא גלוטמין	גיבקו	10313039
צינורות בז BD, 50 מ"ל	פישר סיינטיפיק	14-959-49א
סרום בקר עוברי	גיבקו	10437-028
מלקחיים פרימיום לרקמות, 1 x 2 שיניים 5 אינץ', פלדה גרמנית	פישר סיינטיפיק	13-820-074
רצועת בדיקת שתן גלוקוז	בית מרקחת לחיות מחמד בקליפורניה	U-TSG100	או להשתמש ברצועת בדיקה דומה למדידת גלוקוז בשתן/דם
GlutaMAX–1 (פי 100)	גיבקו	35050-061
מנורת חימום אינפרא אדום	קול פרמר	03057-00	לחלופין, השתמש במנורת אינפרא אדום דומה
מזרק אינסולין 0.5 מ"ל, U-100 29 גרם 0.5 אינץ	בקטון דיקינסון	309306
איזופלורן, USP (הפרמקופיאה האמריקאית)	טיפול נמרץ פיראמלי	6679401725
מערכת הדמיה IVIS Spectrum in vivo	פרקין אלמר	124262	מכשיר לאיסוף לא פולשני של תמונות ביולומינסנטיות של תאים מושתלים
תוכנה לניתוח תמונות חיות	פרקין אלמר	128113	תוכנה לאיסוף וכימות אות ביולומינסנט
צינורות מיקרוצנטריפוגות חותמות, 1.5 מ"ל	ארה"ב סיינטיפיק	1615-5510	או להשתמש בצינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליים דומים
NIT-1	ATCC	CRL-2055	קו בטא-תאי לבלב המופק מעכברי NOD/Lt
הנהון. Cg-Prkdcscid/J	מעבדת ג'קסון	1303	עכברים הומוזיגוטים עבור המוטציה הספונטנית של חסר חיסוני משולב חמור Prkdcscid, המכונה בדרך כלל scid, מאופיינים בהיעדר תאי T ותאי B פונקציונליים, לימפופניה, hypogammaglobulinemia, ומיקרו-סביבה hematopoietic נורמלי.
NOD/ShiLtJ	מעבדת ג'קסון	1976	זן NOD/ShiLtJ של עכברים (נקרא בדרך כלל NOD) הוא מודל פוליגני לסוכרת אוטואימונית מסוג 1
PBS, pH 7.4	תרמו פישר סיינטיפיק	10010031	ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדום
pCMV-VSV-G	אדג'ין	8454
pLenti-luciferase-פיצוץ	מיוצר בבית	פלסמיד זמין על פי בקשה	ראה קובץ משלים 1
pMD2.G	אדג'ין	12259
pMDLg/pRRE	אדג'ין	12251
פוליאתילנימין, ליניארי, MW 25,000, דרגת טרנספקציה (PEI 25K)	פישר סיינטיפיק	NC1014320
pRSV-Rev	אדג'ין	12253
ריסון למכרסמים, בסגנון ברום עגול 1 ב	פישר סיינטיפיק	01-288-32א
מספריים, חדים ומחודדים	פישר סיינטיפיק	08-940	או להשתמש במספריים אחרים העשויים מפלדת אל-חלד ברמה כירורגית
תרביות רקמה שטופלו בתרביות תרבית	מיליפור סיגמא	CLS430167-20EA	או להשתמש בצלחות פטרי סטריליות אחרות שטופלו בתרבית תאים
פינצטה/מלקחיים, דיוק עדין עם קצוות בינוניים	פישר סיינטיפיק	12-000-157