חיסון תוך עורי עם ספורוזואיטים חיים מוחלשים במודל עכבר

תקציר

מקור: Mac-Daniel, L., et al. בידוד תאים מיאלואידים מעור העכבר ומבלוטות הלימפה המתנקזות לאחר חיסון תוך-עורי בספורוזואיטים חיים של פלסמודיום מוחלש. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים בדיקה לחיסון מודל עכבר עם ספורוזואיטים חיים מוחלשים. הפלסמודיום ספורוזואיטים המוחלשים בקרינה מוזרקים לצד הגבי של אוזנו של העכבר. לאחר הזרקות במספר מקומות בשתי האוזניים, העכבר רשאי להתאושש.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. חומרים וריאגנטים

1. השתמשו בנקבות יתושי אנופלס סטפנסי (זן Sda500) הניזונות מעכברים נגועים 3-5 ימים לאחר הופעתם ומאחוריהם כפי שתואר קודם לכן.
2. השתמש בטפילים Plasmodium berghei ANKA clone המבטאים את הגן Green Fluorescent Protein (GFP) תחת שליטתו של מקדם החלבון המכונן Heat Shock Protein 70 (HSP70). זה מניב פלואורסצנטיות בהירה לאורך כל מחזור החיים של הטפיל.
3. השתמש בנקבות עכברי C57BL/6JRj (בני 7 שבועות).
   הערה: כל הריאגנטים המשמשים בפרוטוקול המתואר מפורטים ב- T able of Materials/Equipment.

2. בידוד ספורוזואיטים מוחלשים מבלוטות רוק יתושים

1. בין 18-25 ימים לאחר ארוחת הדם הזיהומי, יש לאסוף ולהרדים יתושים קרים לתוך צינור של 15 מ"ל על קרח כפי שתואר קודם לכן. העבירו אותם בזהירות לצלחת פטרי על ידי היפוך הצינור. שמרו על החרקים על קרח וחשפו את היתושים למנה של 12 קראד של הקרנת γ או רנטגן.
2. בודדו ספורוזואיטים מוחלשים מבלוטות רוק יתושים מוקרנות כפי שתואר קודם לכן. לאסוף בלוטות רוק נגועות בנפח קטן (סביב 15 μl) של 1x Dulbecco's פוספט buffered מלוחים (DPBS) על קרח ולמחוץ אותם בעדינות כדי לשחרר sporozoites.
   הערה: הזרקה של תרחיף טפיל מרוכז מאוד בנפח קטן היא קריטית, ולכן חיוני לקצור מספר מספיק של בלוטות רוק ממספר גבוה של יתושים נגועים היטב שנבחרו מראש, כפי שמעיד הביטוי החזק שלהם של פלואורסצנטיות ירוקה.
3. סננו את תרחיף הספורוזואיטים דרך מכסה מסננת תאים בגודל 35 מיקרומטר המותאם לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל בהדבקה נמוכה על מנת לסלק גושים ושאריות יתושים.
4. ספור את המספר הכולל של ספורוזואיטים מבודדים כפי שתואר קודם לכן והתאם את ריכוז תרחיף הטפילים עם DPBS קר 1x כדי להשיג 83,000 ספורוזואיטים / μl. אחסן את הטפילים על קרח תוך המשך השלבים הבאים.
5. לאסוף את המספר המקביל של בלוטות רוק מיתושים לא נגועים שישמשו כהדברה שלילית ולעבד את הדגימה כמתואר בשלבים 2.2 ו -2.3. לדלל את הדגימה כפי שצוין לעיל כדי לקבל ריכוז דומה של תמציות בלוטת הרוק בתרחיף.
   הערה: ניתן לאחסן ספורוזואיטים על קרח למשך שעתיים לכל היותר. עם זאת, באופן אידיאלי הם מוזרקים בתוך שעה לאחר ריסוק בלוטות הרוק.

3. הזרקת ספורוזואיטים לשכבת העור של האוזן

1. מרדימים בעלי חיים על ידי הזרקה תוך צפקית של קטמין (50 מ"ג/ק"ג)/קסילזין (5 מ"ג/ק"ג). יש להמתין 5-8 דקות עד שהעכבר יהיה במצב של חוסר הכרה ולמרוח משחה אופתלמית על העיניים כדי למנוע התייבשות הקרנית. להעריך את עומק ההרדמה על ידי ביצוע צביטה עדינה בבוהן בשתי כפות הרגליים האחוריות.
   הערה: מינון ההרדמה נמשך פחות מ -20 דקות, ולכן השלבים הבאים חייבים להיעשות במהירות.
2. ייצבו את פין האוזן של העכבר על-ידי קיבוע הצד הגחוני בעזרת סרט דבק שקוף שהונח בעבר מתחת לסטריאומיקרוסקופ (איור 1A). לחץ בעדינות על האוזן כדי למנוע נזק של כלי הדם.
3. טען מזרק 10 μl / מחט משופעת מד 35 עם 0.6 μl של טפילים מושהים.
4. העבירו את תרחיף הספורוזואיטים ב-4 אתרי הזרקה (0.15 מיקרוליטר לאתר) על-ידי החדרה זהירה של המחט בצד הגבי של האוזן (איור 1A), מתחת לאפידרמיס, כשהשיפוע כלפי מעלה, תוך הקפדה להימנע מכלי דם. אפשר למחט להישאר בדרמיס למשך מספר שניות כדי למנוע זרימה חוזרת של המזרק לפני הסרתו. שימו לב לפפולה אופיינית בכל אתר הזרקה בסוף ההליך (איור 1B ו-1C).
5. לאחר ההזרקה, בזהירות להסיר את האוזן מן הקלטת.
6. להזריק את האוזן contralateral עם אותו מינון של טפילים על ידי ביצוע השלבים 3.2-3.4.
7. הזריקו ל-2 עכברים נוספים 0.6 μl של 1x DPBS או 0.6 μl של 1x DPBS + תמצית בלוטת הרוק מיתושים לא נגועים על מנת להעריך את התגובה הדלקתית המתווכת על ידי ההזרקה בלבד ואת שקיעת חומר היתושים בדרמיס.
8. עקוב אחר התאוששות העכבר מהרדמה לפני החזרתו לכלוב.
   הערה: ניתן לנטר את שקיעת הספורוזואיטים המתאימה בעור באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2A ו-2B), כאשר העכבר מוכן כפי שתואר קודם לכן.

תוצאות

איור 1: הזרקה של ספורוזואיטים לאוזן של עכבר. (A) תמונה המראה הזרקה תוך-עורית של ספורוזואיטים בפין האוזן של עכבר מורדם. הצד הגחוני של האוזן מיוצב באמצעות סרט שקוף שהונח בעבר תחת מיקרוסקופ מנתח. המחט מוחדרת בזהירות בצד הגבי של האוזן, מתחת לאפידרמיס, כשהשיפוע כלפי מעלה. (ב-ג) תמונות המראות את הצד הגבי של האוזן לפני (B) ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קטמין: Imalgene® 1000	מריאל	-	-
קסילזין: רומפון® 2%	באייר	-	-
מזרק NanoFil + מחט מד 35	מכשירים מדויקים בעולם	-	-
מזרק אינסולין Omnican® 50 0.5 מ"ל/50 יב"ל	ב. בראון מדיקל	9151125	-
צלחת תרבית רקמה MultiwellTM 6 – תחתית שטוחה	BD בז	353046	-
מסננת תאים 70 מיקרומטר	BD בז	352350	-
2 מ"ל מזרק	תרומו	SS-02S	-
BLUE MAXTM 15ml צינור חרוטי פוליפרופילן	BD בז	352097	-
BLUE MAXTM 50ml צינור חרוטי פוליפרופילן	BD בז	352098	-
5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול עם מכסה מסננת תאים 35μm	BD בז	352235	-
DPBS 1X Cacl2- ו- MgCl2 חינם	לייף טכנולוגיות	14190-094	-
DMEM 1X + GlutaMAXTM	לייף טכנולוגיות	31966-021	-
Deoxyribonuclease I מלבלב בקר, סוג IV	סיגמא-אולדריץ'	D5025	50 מיקרוגרם/מ"ל
נקבת עכברי C57BL/6JRj (בת 7 שבועות)	מעבדות ג'נוויאר	-	-