1. גידול תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (hiPSCs) על פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEF)
הערה: ניתן להשתמש גם בשיטות חלופיות לגידול hiPSCs, כולל אך לא מוגבל לזריעה על צלחת בת 6 בארות המצופה מראש בג'לטין, תערובת חלבונים ג'לטינית, למינין רקומביננטי 511, או כל מטריצה חוץ-תאית אחרת המשמשת להרחבת hiPSC, ותרבית באמצעות מדיה מוגדרת שפותחה במיוחד עבור תרבית תאי גזע פלוריפוטנטית אנושית.
- מטפחים MEF
- מצפים צלחת פטרי תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ ב-4 מ"ל של 0.1% ג'לטין ודגרים במשך 30 דקות ב-37°C.
- הפשיר בקבוקון של 4 x 106 MEF מוקרן במהירות לתוך 10 מ"ל של 37 ° C MEF מדיה (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] + 10% סרום בקר עוברי (FBS) + 1x פניצילין-סטרפטומיצין + 1x L-גלוטמין מוסף). צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לשאוף את supernatant ולהשהות מחדש את גלולת התא ב 9 מ"ל של מדיה MEF.
- מוציאים את התבשיל מצופה הג'לטין מהאינקובטור. שואפים ג'לטין ומוסיפים 7 מ"ל של מדיה MEF. צלחת 3 מ"ל של מתלה MEF (משלב 1.1.2) על צלחת מצופה ג'לטין. ערבבו את המנה מצד לצד ומלפנים לאחור כדי להבטיח פיזור אחיד של MEF על המנה. לדגור ב 37 ° C במשך 8-36 שעות.
- העברת hiPSC ב- MEF
הערה: הנתונים הופקו באמצעות אנטיגן מלנומה המוכר על ידי תאי T 1 (MART-1) iPSC הנגזר מלימפוציטים חודרי גידול מלנומה לטווח ארוך (TIL), אשר מזהה באופן ספציפי פפטיד MART-1 בהקשר של אנטיגן לויקוציטים אנושי (HLA)-A*02:01.
- מעבר hiPSCs כאשר מושבות הן בין 0.8 - 1.2 מ"מ קוטר. לפני המעבר, בדוק מושבות hiPSC במיקרוסקופ סטריאו והסר את כל אזורי הבידול מהתרבית באמצעות קצה הפלסטיק של קצה 200 μL.
- לשאוף מדיה משומשת ולהוסיף 10 מ"ל hiPSC מדיה (תא גזע עוברי אנושי [ES] מדיה תרבית [טבלה של חומרים] + 10 ng / mL גורם גדילה פיברובלסט בסיסי אנושי [hbFGF]) בתוספת 10 μM Rho-associated protein kinase (ROCK) מעכב
.
- החזיקו את צלחת תרבית התאים ביד אחת וגלגלו כלי חד פעמי להעברת תאים על פני כל הצלחת בכיוון אחד. הפעילו מספיק לחץ כך שכל הרולר בליידס ייגע בצלחת התרבית וישמור על לחץ אחיד במהלך פעולת הגלגול.
- סובבו את צלחת התרבית ב-90° וחזרו על שלב 1.2.3. הצג את הצלחת במיקרוסקופ כדי לאשר חזותית את החיתוך הנכון של המושבות, אשר אמור להיראות משובץ. נתק מושבות חתוכות על ידי שטיפה מכנית עדינה באמצעות פיפטה 200 μL.
הערה: ניתוק מושבות חתוכות על ידי שטיפה מכנית חייב להיעשות מיד לאחר חיתוך מושבות עם הרולר מכיוון שלאחר 3 דקות, המושבות החתוכות יתחילו להתחבר מחדש לצלחת, ויהיה קשה לנתק מושבות בגודל הומוגני על ידי שטיפה.
- העבירו 350 - 600 גושים של מושבות חתוכות לצלחת חדשה של MEF בקוטר 10 ס"מ (מצופה 8 - 36 שעות לפני מעבר hiPSC) עם 10 מ"ל של מדיה hiPSC טרייה בתוספת מעכב ROCK של 10 מיקרומטר. דגירה ב 37 ° C.
הערה: 600 גושים מייצגים בערך 1.0 x 106 MART-1 iPSC ויניבו 0.5-1.0 x 106 תאי DP ביום ה-35. עם זאת, המספרים הצפויים ישתנו בהתאם לעוצמה של קו התא ההתחלתי ותנאי התרבית.
- למחרת, לשאוף מדיה בילה ולהוסיף 10 מ"ל של מדיה hiPSC טרי. שנה מדיה hiPSC כל 1-2 ימים, בהתאם לקצב הצמיחה hiPSC.
2. הכנת תאי OP9/DLL1 לתרבית משותפת עם hiPSCs
- תרבית תאי OP9/DLL1 במדיית OP9 [α-מדיום חיוני מינימלי (α-MEM) + 20% סרום בקר עוברי (FBS) + 1x פניצילין-סטרפטומיצין] ב-37°C. כאשר תאי OP9/DLL1 מגיעים למפגש, יש לשאוף מדיה ולשטוף פעם אחת עם 5 מ"ל של 1x מגנזיום, סידן ופנול ללא פוספט חוצץ מלוחים (PBS).
- שאפו PBS והוסיפו 2 מ"ל של 0.05% חומצה טריפסין-אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA). יש לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37°C. לאחר מכן, הוסף 4 מ"ל של מדיה OP9 לנתק מכנית את שכבת התא על ידי pipetting כדי ליצור תרחיף תא יחיד.
- העבירו את תרחיף התא לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר כדי למנוע גושי תאים. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לשאוף את supernatant ו resuspend ב 12 מ"ל של מדיה OP9.
- הוסף 8 מ"ל של חומרי אחסון OP9 לשש צלחות פטרי חדשות בתרבית תאים בקוטר 10 ס"מ. צלחת 2 מ"ל של תרחיף תאים OP9/DLL1 משלב 2.3 לכל צלחת חדשה בקוטר 10 ס"מ. ערבבו את המנה מצד לצד ולאחר מכן מלפנים לאחור כדי להבטיח פיזור אחיד של OP9/DLL1 על המנה.
- לדגור ב 37 °C. לחזור על המעבר כל 2 - 3 ימים כאשר התאים מגיעים confluency.
הערה: חשוב לייצר מלאי קפוא מספיק של תאי OP9/DLL1 ולהפשיר מלאי חדש כל 4-6 שבועות.
3. התמיינות חוץ גופית של hiPSCs לתאי T חיוביים בודדים (SP) CD8αβ+
- הכינו מנות OP9/DLL1 מג'לטיניות שבוע לפני התרבות המשותפת עם hiPSCs. כדי להכין תמיסת ג'לטין 0.1%, הוסף 5 מ"ל של תמיסת ג'לטין מלאי באיכות רקמה בטמפרטורת החדר (RT) ל- 500 מ"ל PBS.
- מצפים 3 צלחות פטרי חדשות בתרבית תאים בקוטר 10 ס"מ על ידי הוספת 4 מ"ל לצלחת של 0.1% ג'לטין. יש לדגור 30 דקות ב-37°C.
- שאפו ג'לטין והוסיפו 8 מ"ל של חומרי OP9 לכל מנה. מעבירים מנה אחת של OP9/DLL1 (כפי שנעשה בסעיף 2 לעיל) לשלוש מנות מצופות מראש בג'לטין.
- לאחר 4 ימים, יש להוסיף 10 מ"ל של חומרי הדפסה OP9 לכל צלחת של 10 ס"מ של OP9/DLL1 על ג'לטין לקבלת 20 מ"ל של מדיה לכל מנה.
- לאחר 7 - 8 ימים, התחל את התרבות המשותפת hiPSC על מנות OP9 / DLL1 confluent (יום בידול 0).
- Aspirate בילה מדיה מן צלחת 10 ס"מ של hiPSCs על MEF. הוסף 10 מ"ל של מדיה OP9. גזור ונתק מושבות hiPSC באמצעות כלי העברת תאים חד פעמי, כפי שנעשה בשלבים 1.2.3 ו- 1.2.4.
- מעבירים 350 - 600 גושים של מושבות חתוכות לצלחת OP9/DLL1 בקוטר 10 ס"מ (שלב 3.1) עם 10 מ"ל של חומרי OP9 טריים באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר. רוק את צלחת התרבות מצד לצד ולאחר מכן מלפנים לאחור כדי להבטיח חלוקה שווה של מושבות.
הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בגופי עובר hiPSC (EBs) או בתרחיף גושי קטן. עם זאת, שימוש בכלי העברת תאים חד פעמי או מערכת היווצרות EB עדיף לייצר גושי hiPSC בגודל אחיד.
- ביום הראשון, שאפו מדיה משומשת והחליפו אותה ב-20 מ"ל של מדיה OP9 טרייה. גושי hiPSC שעברו תרבית משותפת ב-OP9/DLL1 במשך יום אחד יופיעו כמושבות חד-שכבתיות עגולות קטנות (איור 1).
- ביום 5, שאפו 10 מ"ל של מדיה משומשת והוסיפו 10 מ"ל של מדיה OP9 טרייה. מושבות hiPSC יתחילו להתמיין למזודרם פרימיטיבי, המאופיין במרכז כהה רב שכבתי.
- ביום 9, שאפו 10 מ"ל של מדיה משומשת והוסיפו 10 מ"ל של מדיה OP9 טרייה. בשלב זה, מבנים מרכזיים רב-שכבתיים יתפתחו לצורות דמויות כיפה, ושטח דמוי רשת היקפית יתברר.
- ביום ה-13, קצרו תאי אב המטופויטיים (HPC) (איור 1). מבנים שמקורם ב-hiPSC ביום ה-13 מאופיינים באורגנואיד מרכזי כהה המוקף ברשת של אזורים דמויי כיפה, המייצגים אזורים המטופויטיים (HZs) שדווח בעבר כי הם מקיפים אבות המטופויטיים שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים.
הערה: נוכחותם של מבנים דמויי כיפה מעידה על תהליך מוצלח גם בהיעדר מרכזים כהים. חוסר היכולת לייצר HPC עשוי לנבוע מאיכות ירודה של OP9/DLL1, איכות לוט FBS, מפגש של גושי iPSC שנזרעו על OP9/DLL1 (350-600 גושים הוא אופטימלי), ו / או שינויים בעוצמה של קווי iPSC לייצר מבשרים hematopoietic.
- לשאוף מדיה משומשת ולשטוף 1x עם 5 מ"ל של 1x פנול ללא אדום תמיסת מלח מאוזנת של הנקס שונה עם סידן ומגנזיום (HBSS).
- שאפו HBSS והוסיפו 250 μL של 5000 יחידות/מ"ל collagenase IV ב-10 מ"ל HBSS. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 45 דקות. יש לשאוף HBSS עם collagenase IV ולשטוף פעם אחת עם 5 מ"ל של PBS.
- שאפו PBS והוסיפו 5 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות. לאחר מכן, הוסף 4 מ"ל של מדיה OP9 לנתק את שכבת התא על ידי pipetting כדי ליצור תרחיף תא יחיד.
- מעבירים את מתלה התא לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לשאוף את supernatant ו resuspend ב 10 מ"ל של מדיה OP9.
- תרחיף תא צלחת על צלחת פטרי חדשה מג'לטינית בקוטר 10 ס"מ (ראה שלבים 3.1.1 ו-3.1.2). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 45 דקות. לאחר מכן, לאסוף תאים שאינם דבקים על ידי pipetting עדין.
- העבר את תרחיף התאים שנאסף לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לשאוף את supernatant ו resuspend ב 10 מ"ל של מדיה התמיינות [OP9 מדיה עם 5 ng / mL גורם תאי גזע אנושי (hSCF), 5 ng / mL אדם Flt3 ליגנד (hFLT3L), ו 5 ng / mL אינטרלוקין אנושי 7 (hIL-7)].
- מעבירים את מתלה התא לצלחת חדשה בקוטר 10 ס"מ OP9/DLL1.
- ביום ה-16 עוברים בין התאים.
- נתק באופן מכני תאים שאינם נדבקים על ידי פיפטינג עדין וסנן דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לשאוף את supernatant ו resuspend ב 10 מ"ל הבחנה מדיה.
- מעבירים את מתלה התא לצלחת חדשה בקוטר 10 ס"מ OP9/DLL1.
- המשך להעביר תאים שאינם דבקים כל 5-7 ימים לאחר מכן על ידי חזרה על שלב 3.8.
- ביום ה-35, העשירו את אוכלוסיית CD4+CD8+ כפול חיובי (DP) ועוררו לייצר תאי T חיוביים בודדים (SP) CD8αβ+ (איור 2).
- נתק באופן מכני תאים שאינם נדבקים על ידי צנרת וסינון עדינים דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר כדי להסיר גושים. להעשיר את אוכלוסיית תאי CD4+ על ידי בידוד חרוזים מגנטיים CD4 על פי פרוטוקול היצרן.
הערה: הרציונל לשימוש בחרוזים מגנטיים CD4 הוא להסיר תאי CD4-CD8- שליליים כפולים (DN) מהתרבית, שכן אלה הוכחו כגורמים להרג ישיר של תאי DP CD4+CD8+ לאחר גירוי.
- ספרו תאים חיים מועשרים ב-CD4 באמצעות המוציטומטר נויבאואר וצבע כחול טריפאן. השהיה במדיית OP9 בריכוז כולל של 0.5 x 106 תאים/מ"ל. Aliquot 1 מ"ל של תרחיף התא (0.5 x 106 תאים) לתוך כל באר של תרבית רקמה תחתית שטוחה 24 לוחות בריאים של OP9 / DLL1 confluent.
- הוסף 100 IU אינטרלוקין אנושי 2 (hIL-2), 5 ng / mL hIL-7, 500 ng / mL נוגדן CD3 אנטי אנושי, ו 2 מיקרוגרם / מ"ל נוגדן CD28 אנטי אנושי, ולאחר מכן תרבית ב 37 ° C.
