1. יצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים
- תרבית פיברובלסטים אנושיים ב- DMEM בתוספת סרום בקר עוברי 10% (FBS) בצלחות 6 בארות.
- לפני תחילת תכנות מחדש של פיברובלסטים, יש לצפות 6 בארות במטריג'ל ולדגור לפחות שעה בטמפרטורת החדר. במפגש של 80%, יש להסיר מדיה מתרביות פיברובלסטים ולשטוף פעם אחת במי מלח חוצצי פוספט (PBS).
- הוסיפו כמות מספקת של 0.25% טריפסין-EDTA כדי לכסות את הצלחת כולה ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות.
- לאחר שהתאים נעקרו מבארות, הוסיפו כמות כפולה של DMEM עם 10% FBS מזו של טריפסין כדי להרוות את עיכול הטריפסין. תרחיף תאי פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לפרק תאים. לספור את מספר התאים בודדים עם hemocytometer.
- מעבירים 7 x 105 תאים לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל וצנטריפוגה את תרחיף התא ב 200 x גרם למשך 5 דקות.
- הסר supernatant ו resuspend תא גלולה בתמיסת electroporation. אלקטרופורציה של הפיברובלסטים בהתאם להוראות היצרן. תאי השעיה מחדש ב 100 μl של חיץ אלקטרופורציה ולהוסיף 1 מיקרוגרם של כל וקטור אפיזומלי. תאים אלקטרופורטיים עם הגדרות של 1,650 וולט, 10 אלפיות השנייה ו-3 פעימות זמן.
- העברת תרחיף התא למדיום הנשר המעובד (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% FBS וצלחת 5 x 104 תאים לכל באר של צלחת 6 בארות. יש לדגור על צלחות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
- לאחר 48 שעות, הסר מדיה מתרביות פיברובלסטים נגועות והחלף בתווך mTeSR. יש להחליף את אמצעי התרבית מדי יום עד שמושבות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) מוכנות לבידוד. מושבות iPSC ניתן לראות לאחר 28-35 ימים.
- כאשר אתם מוכנים לבידוד, חתכו באופן מכני מושבת iPSC וזרעו מחדש בתווך mTeSR עם מעכב חלבון קינאז הקשור ל-Rho (ROCK) של 10 מיקרומטר (Y-27632) על צלחת בת 6 בארות מצופת מטריג'ל. החלף את מדיום התרבות מדי יום.
2. אינדוקציה עצבית ותחזוקה של NPCs אנושיים
- כאשר תרביות iPSC הן סביב 20% מפגש, להסיר את מדיום mTeSR ולהחליף בתווך אינדוקציה עצבית. לחדש בינוני כל יום שני.
- לאחר 7 ימים, הסר את מדיום ההשראה העצבית והחלף במדיום תחזוקת NPC אנושי. לחדש בינוני כל יום שני עד 7 ימים לפני תרביות חולפות.
- לפני העברת תרביות, יש לעטוף צלחות/צלוחיות עם מטריג'ל בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות.
- הסר מדיה מתרביות NPC אנושיות משתלבות ושטוף פעם אחת עם PBS 1x ואז לשאוף PBS כבוי.
- הוסף מספיק תמיסת ניתוק תאים כדי לכסות את כל הבארות ולאחר מכן לדגור במשך 5 דקות ב 37 ° C.
- ודא שכל התאים התנתקו. הוסף כמות כפולה של DMEM/F-12 (תערובת F-12 של Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Blend) מזו של תמיסת ניתוק תאים לבארות/צלוחיות.
- העבר תאים המכילים DMEM/F-12 לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל וצנטריפוגה במהירות של 200 x גרם למשך 5 דקות.
- הסר תאי supernatant והשהה מחדש במדיום תחזוקת NPC אנושי של 5 מ"ל. תרחיף תאי פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לפרק תאים.
- יש להכניס שליש מכלל התאים לבארות/צלוחיות תרבית מצופות מטריג'ל ולמלא מספיק מדיום בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632. לדגור על כלי תרבית ב 37 ° C ו 5% CO2.
- לפצל תרביות 1:3 כל 3 עד 4 ימים ולחדש את הבינוני כל יומיים. שמור על תרבויות NPC אנושיות בצפיפות גבוהה כדי למנוע בידול.
3. התמיינות של NPCs אנושיים לתאי עצב בתרבויות משותפות
- הוסף את הווקטור הלנטיויראלי Synapsin1-tdTomato לתרבית NPC אנושית לפני התחלת התמיינות לנוירונים. הכינו תרביות משותפות של אסטרוציטים/נוירונים בקליפת המוח יום מראש לפני שתבחינו בין NPCs אנושיים.
- שטפו תרביות NPC אנושיות פעם אחת עם PBS 1x והוסיפו מספיק תמיסת ניתוק תאים כדי לכסות את כל הבארות/צלוחיות ואז לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37°C.
- ודא שכל התאים התנתקו. הוסף כמות כפולה של DMEM/F-12 מזו של תמיסת ניתוק תאים לבארות/צלוחיות. מעבירים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
- הסר supernatant ו resuspend תאים בתווך התמיינות עצבית 5 מ"ל. תרחיף תאי פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לפרק את כדורי התא לתאים בודדים. לספור את מספר התאים בודדים עם hemocytometer.
- שאפו בזהירות מדיום מתרביות אסטרוציטים/נוירונים בקליפת המוח. צלחת NPCs אנושיים ב 5 x 103 תאים / ס"מ2 ב 500 μl של מדיום התמיינות עצבית בתוספת 10 μM Y-27632 עבור כל 24-באר. הוסיפו בעדינות מדיום המכיל NPCs אנושיים לכל באר כדי למנוע הפרעה לאסטרוציטים ולנוירונים בקליפת המוח.
- יש לדגור על צלחות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2. החליפו מחצית מהמדיום בתווך טרי כל יומיים-שלושה למשך 28 ימים לפחות.
