כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת נוזל מוחי סטנדרטי-מלאכותי (aCSF)
- הכנת מלאי פתרון א'
- הוסיפו 700 מ"ל מים מזוקקים לכוס נקייה בנפח 1 ליטר לפני הוספת כימיקלים.
- תוך ערבוב מתמשך של נפח של 500 מ"ל, להוסיף 136.75 גרם של NaCl, 6.99 גרם של KCl, 2.89 גרם של MgSO4, ו 2.83 גרם של NaH2PO4.
- מוסיפים עוד מים מזוקקים כדי להגיע לנפח סופי של 1 ליטר. לאחר דילול, הריכוז הסופי של כל תרכובת הוא 117 mM NaCl, 4.69 mM KCl, 1.2 mM MgSO4 ו- 1.18 mM NaH2PO4.
- יש לשמור בקירור בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
- הכנת מלאי פתרון B
- הוסיפו 700 מ"ל מים מזוקקים לכוס נקייה בנפח 1 ליטר לפני הוספת כימיקלים.
- תוך ערבוב מתמשך של נפח של 500 מ"ל, להוסיף 41.45 גרם של D-גלוקוז ו 41.84 גרם של NaHCO3.
- מוסיפים עוד מים מזוקקים כדי להגיע לנפח סופי של 1 ליטר. לאחר דילול, הריכוז הסופי של כל תרכובת הוא 11.5 mM D-glucose ו 24.9 mM NaHCO3.
- יש לשמור בקירור בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
- לפני כל ניסוי יש לערבב 50 מ"ל מלאי A עם 50 מ"ל ציר B ולהביא ל-1 ליטר עם מים מזוקקים לקבלת תמיסת aCSF בריכוז סופי ולהשאיר ב-RT תוך חמצון רציף בקרבוגן (95% O2 - 5% CO2 לערבב) למשך 30 דקות לפחות. הכינו את הריכוז הסופי aCSF רק בתחילת כל ניסוי והשליכו בסוף היום.
2. הכנת סוכרוז-נוזל מוחי מלאכותי (Sucrose-aCSF)
- הכנת מלאי פתרון C
- הוסיפו 700 מ"ל מים מזוקקים לכוס נקייה בנפח 1 ליטר לפני הוספת כימיקלים.
- תוך כדי ערבוב מתמשך של 500 מ"ל מים מזוקקים, להוסיף 240 גרם סוכרוז, 6.55 גרם של NaHCO3, 0.671 גרם של KCl, 4.88 גרם של MgCl2, 0.22 גרם של CaCl2, ו 0.21 גרם של חומצה אסקורבית.
- מוסיפים עוד מים מזוקקים כדי להגיע לנפח סופי של 1 ליטר. לאחר דילול, הריכוז הסופי של כל תרכובת הוא 701.1 mM סוכרוז, 78 mM NaHCO3, 9 mM KCl, 24 mM MgCl2, 1.5 mM CaCl2, ו 1.2 mM חומצה אסקורבית.
- שמור את המלאי של תמיסה C בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע.
- לפני כל ניסוי, מערבבים 300 מ"ל של 50 מ"ל של מלאי C עם 600 מ"ל מים מזוקקים כדי לקבל את תמיסת סוכרוז-aCSF בריכוז הסופי. יש להשאיר ב-RT תוך כדי חמצון מתמשך של קרבוגן (תערובת של 95% O2 - 5% CO2) למשך 30 דקות לפחות.
3. הכנת פרוסות
- הניחו נקייה עם תמיסת סוכרוז-aCSF של 100 מ"ל בקרח תוך כדי חמצון שלה בקרבוגן וקיבעו את ה- pH על 7.4 באמצעות מד pH תוך הוספת כמה טיפות של תמיסת 0.1 M NaOH (כאשר pH < 7.4) או תמיסת 0.1 M HCl (כאשר pH > 7.4).
- ממלאים תא חיתוך של ויברטומה בסוכרוז-aCSF ומחמצנים אותו. הפעל את מערכת הקירור מבוססת הגליצרול המחוברת לתא החיתוך והמתן 15 דקות כדי לאפשר לה להתקרר ל 0 - 4 ° C.
- הרדימו גורי חולדות (בגילאי 9 עד 12 מחולדות Sprague-Dawley בוגרות בהריון) עם קטמין (70 מ"ג/ק"ג, כלומר באמצעות < 50 מיקרוליטר נפח סופי). כאשר הגור רגוע, בדקו שוב שרפלקס צביטת הזנב נעדר.
- ערפו את ראשיהם של גורים.
- חתכו את עור הראש לאורכו מהחזית לאחור באמצעות להב אזמל מפלדת פחמן, ומשכו את העור לצדדים באמצעות מלקחיים. חותכים את העצם המכסה את המוח, מזיזים את המספריים לרוחב, ומוציאים אותה לחלוטין כדי לחשוף את המוח.
- לאחר מכן, הסר במהירות את המוח באמצעות מרית (בתחילה ממוקם מתחת לנורת הריח כדי לדחוף אותו בעדינות החוצה מן הרוסטרל ביותר לכיוון האזורים הקאודליים ביותר). דחפו בעדינות את המוח לתוך נוזל מוחי מלאכותי מקורר קרח סוכרוז מלאכותי (סוכרוז-aCSF).
- בצע חתך parasagittal על ההמיספרה הימנית (הסרת כשליש של חצי הכדור), והדביק את הצד החתוך של המוח על דיסק מתכתי כי יהיה מקובע מגנטית לתא חיתוך של vibroslicer לחתוך 400 מיקרומטר sagittal חלקים המכילים את הגרעין pedunculopontine (PPN). שמור פרוסות PPN ב- RT למשך 45 דקות לפני הקלטות מהדק טלאים של תאים שלמים.
4. הקלטות של תנודות פס גמא בפרוסות PPN
- הכנת תמיסה תוך-תאית אשלגן-גלוקונאט (תמיסת High-K+)
- מניחים בקרח נקייה עם 10 מ"ל מים מזוקקים. תוך כדי ערבוב מתמשך הוסיפו: K+-גלוקונאט, 90.68 מ"ג פוספוקריאטין די מלח טריס, 47.66 מ"ג HEPES, 1.5 מ"ג EGTA, 40.58 מ"ג מ"ג2+-ATP ו-4 מ"ג Na+2-GTP.
- כוונן את רמת החומציות ל-7.3 עם KOH (100 מילימטר במים מזוקקים). מוסיפים מים מזוקקים כדי להגיע לנפח סופי של 20 מ"ל. במידת הצורך, התאימו את האוסמולריות עם סוכרוז (100 מ"מ במים מזוקקים) ל-280 - 290 מ"מ. לאחר דילול, הריכוז הסופי של כל תרכובת הוא 124 mM K+-gluconate, 10 mM phosphocreatine di Tris salt, 10 mM HEPES, 0.2 mM EGTA, 4 mM Mg2+-ATP ו- 0.3 mM Na+2-GTP.
- Aliquot תמיסות תוך תאיות בצינורות 1 מ"ל ולהקפיא ב -20 ° C. השתמש aliquot אחד ליום ולשמור על 4 ° C במהלך ניסויים.
- הקלטות מהדק טלאי של תאים שלמים
- מניחים פרוסות בתא טבילה ומחוררים אותן (1.5 מ"ל/דקה) עם חמצן (95% O2 - 5% CO2) aCSF המכיל את אנטגוניסטים הקולטן הבאים: אנטגוניסט קולטן NMDA סלקטיבי 2-amino-5-phosphonovaleric acid (APV, 40 μM), תחרותי אמפא/Kainate קולטן גלוטמט אנטגוניסט 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX, 10μM), אנטגוניסט קולטן גליצין סטריכנין (STR, 10 μM), אנטגוניסט קולטן GABAA הספציפי gabazine (GBZ, 10 μM), וחוסם תעלות נתרן tetrodotoxin (TTX, 3μM)
מלא את פיפטות טלאי ההקלטה (התנגדות 2-7 MΩ; עשויות מנימי זכוכית בורוסיליקט עבים רגילים הזמינים מסחרית בקוטר חיצוני של 1.0 מ"מ וקוטר פנימי של 0.6 מ"מ) בתמיסת High-K+ תוך תאית באמצעות חומרי מילוי פיפטות טלאי הזמינים באופן מסחרי עם מסנן תמיסה. הכניסו את הפיפט למחזיק המגבר. הפעל לחץ חיובי קטן באמצעות מזרק 1 מ"ל המחובר למחזיק פיפטה באמצעות צינור סיליקון המחובר לשסתום תלת כיווני. חבר את גב מחזיק פיפטה למגבר מהדק טלאי.
- הזז את פיפטת ההקלטה באמצעות מיקרומניפולטור מכני ליד גרעין PPN באמצעות מטרה 4X משולבת לאופטיקת ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות אינפרא אדום קרוב.
הערה: ניתן לצפות בגרעין PPN בפרוסות גביות לפדונקל המוח הקטן העליון (SCP; ניתן לצפות בו כצרור עבה של אקסונים). פיפטות הקלטה היו ממוקמות ב- PPN pars compacta, הממוקם מיד הגבי לקצה האחורי של הפדונקל.
- הבא את פיפטת ההקלטה במגע עם נוירון PPN תוך כדי הדמיה באמצעות עדשת טבילה במים 40X, והפעל במהירות יניקה שלילית כדי ליצור אטם עם התא.
- השתמש בתוכנת אטם מהדק מתח כדי לנטר את התנגדות פיפטה במהלך יניקה שלילית באמצעות פרוטוקול היצרן.
- כאשר היניקה השלילית מוגברת לאט, וערכי ההתנגדות הנקראים על ידי צג מהדק התיקון בקצה פיפטה מגיעים ל 80 - 100 MOhm, שנה במהירות את פוטנציאל האחיזה ל -50 mV ושחרר את הלחץ השלילי. התחל להפעיל ברציפות יניקה שלילית עד לקרע את קרום תא העצב וגישה חשמלית מושגת בתצורת התא כולו.
- אם ערכי התנגדות הגישה שנמדדו על ידי תוכנת אטם מהדק המתח הם 10 MOhm ומעלה, המשך להחיל יניקה שלילית בכמויות קטנות יותר.
- פיצוי קיבוליות (כלומר, מעברים איטיים ומהירים שנצפו לאחר קריעת קרום התא) והתנגדות סדרה במצב מהדק מתח. העבר את מצב ההקלטה למהדק הנוכחי, ופצה במהירות את ערכי הגשר (לדוגמה, הזז את ידית המגבר או לחץ על תפריט הפיצוי האוטומטי באמצעות עכבר המחשב).
- נטר ברציפות את פוטנציאל הממברנה במנוחה של נוירון PPN המתועד באמצעות פרוטוקול היצרן. אם פוטנציאל הממברנה במנוחה משתנה לכיוון ערכים של דה-פולריזציה או היפרפולריזציה, השתמש בכמויות קטנות של זרם ישר (עד 100 pA) כדי לשמור על הערך הסופי האופטימלי -50 mV.
הערה: שמור רק נוירוני PPN עם פוטנציאל יציב של קרום מנוחה (RMP) של -48 mV או יותר hyperpolarized (כלומר, RMP < -48 mV).
