$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. יצירת אוזניות עם שתי אלקטרודות דו-קוטביות (איור 1)
- חותכים 3.5 ס"מ של חוט נירוסטה מצופה פוליטטרה-פלואוראתילן.
- הפשיטו כ-1 מ"מ ממעטפת הבידוד מהחוט משני קצותיו. אין להפשיט יותר מדי מהחוט.
- הניחו שני פינים על מחזיק ויזה כאשר החלק התחתון של הסיכה בעל חריץ ארוך יותר פונה כלפי מטה.
- יש למרוח שטף על הקצוות המופשטים של החוט ועל החלק העליון של הפינים.
- פח את החלק המופשט של החוט עם מספיק הלחמה כדי לצפות אותו.
- הוסיפו כמות מינימלית של הלחמה לחלק העליון של הסיכה מבלי לגלוש לצדדים.
- הניחו קצה אחד של הקצוות המופשטים של החוט לתוך הסיכה עמוק ככל שיאפשר בזמן שההלחמה מותכת.
הערה: יש חור צדדי שבו החוט יכול לצאת - אל תתנו לחוט לצאת מהסיכה. כל החוט שהופשט חייב להישאר בתוך הסיכה.
- חזור על שלבים 1.6-1.7 עבור הסיכה השנייה, כעת עם הקצוות המופשטים האחרים של החוט.
- הניחו לפינים לשבת במשך 30 שניות, הוציאו אותם ממחזיק הוויזה ולאחר מכן משכו אותם כדי לוודא שהחיבור בין החוט לפינים חזק ומחזיק מעמד.
- יש לשטוף את הפינים במים קרים ולאחר מכן לייבש.
- ודא את המוליכות בין פין 1 לפין 2 באמצעות אוהממטר.
- חברו את הפינים בקצות החוט; החזיקו אותם במקביל וקרובים. מהדקים המוסטאט למרכז החוט. לאחר מכן, סובב את hemostat, כך חוט מסתובב סביב עצמו די חזק. הסר את ההמוסטט.
- הדקו מלקחיים על החוט המעוות 2 מ"מ מתחת לפינים וכופפו את החוט ב-90°.
- דחפו את אותו חוט שוב 90° אחורה מעל המלקחיים וצרו כיפוף נוסף 1 מ"מ מהראשון.
- חתכו את החוט המעוות בזווית של 45° מתחת לכיפוף של 3.5 מ"מ בעזרת מספריים קטנים וחדים.
- הכינו שתיים מהאלקטרודות הדו-קוטביות הללו (פין כפול מעוות) עבור כל אוזנייה (אופציונלי, השנייה היא גיבוי במקרה של בעיות חשמל עם הראשונה).
- הכינו אלקטרודת ייחוס אחת על-ידי חיתוך חוט עם פינים מולחמים משני קצותיו לשניים (שלבים 1.1-1.17, איור 1A).
- חותכים את החוט ב 7 מ"מ.
- כופפו את הקצה 1 מ"מ מתחת לקצה.
- לאחר מכן, כסו את קצה החוט המכופף בקוטר 1 מ"מ במלקחיים וסובבו את החוט בחוזקה סביב המלקחיים ליצירת לולאה קטנה (קוטר 1 מ"מ).
- כופפו את הלולאה בניצב לחלק הישר של החוט כדי לגרום לקצה החוט להצביע שוב כלפי חוץ.
- הרכיבו את שתי האלקטרודות הדו-קוטביות ואת אלקטרודת הייחוס היחידה לתוך הכן בעל ששת הפינים באופן שהאלקטרודות הדו-קוטביות נמצאות זו לצד זו עם מרחק של 6 מ"מ ביניהן, ושאלקטרודת הייחוס ממוקמת בחור החיצוני האמצעי (איור 1B).
הערה: שיטה חלופית היא להשתיל את האלקטרודות, לקבע אותן במקומן ולאחר מכן להחדיר את הפינים שלהן לתוך הדום.
2. השתלת אלקטרודות סטריאוטקסיות
- לעקר את כל כלי הניתוח ואת הרכבת אלקטרודות שישה פינים על ידי autoclaving לפני הניתוח. יש לשמור על שדה כירורגי סטרילי במהלך הניתוח, ולהשתמש בכפפות כירורגיות סטריליות. וילונות סטריליים (למשל, Press n' Seal) מומלצים לכיסוי בעל החיים למעט אזור הניתוח.
- השתמש בעכברי VGAT-Cre בני 8 שבועות (המבטאים Cre recombinase תחת שליטת הגן המוביל GABA שלפוחית [VGAT], תואם גיל, זכר ונקבה כאחד) לניתוחים 4 שבועות לאחר הגמילה. רשום את משקל החיה לפני הניתוח כדי לאפשר מדידה של ירידה במשקל לאחר הניתוח.
- השתמש בוופורייזר איזופלורן מוסמך או במערכת הרדמה בזרימה נמוכה המצוידת במשאבת מזרק מדויקת, וופורייזר דיגיטלי משולב ומשטח חום משוב.
הערה: מערכות זרימה נמוכה מסוגלות לספק הרדמה בקצבי זרימה נמוכים ביחס לגודל בעל החיים לתוך תא אינדוקציה או דרך חרוט אף על המסגרת הסטריאוטקסית (70 מ"ל/דקה, ריכוז איזופלורן באוויר הוא 4% לאינדוקציה ו-2% לניתוח). שימוש בפחות הרדמה לא רק מועיל לבעל החיים במהלך ניתוחים, אלא גם מפחית את הסיכון לחשיפה של צוות המעבדה לאיזופלורן.
- הניחו את בעל החיים המרדים על פד מחומם המחומם ל-37°C כדי לשמור על חום גופו במהלך הניתוח. אם אתם משתמשים במערכת טמפרטורה מבוקרת משוב, הכניסו את בדיקת הטמפרטורה המשומנת קלות לפי הטבעת של בעל החיים לצורך ניטור טמפרטורה במהלך הניתוח.
- הרכיבו את בעל החיים על המסגרת הסטריאוטקסית על ידי הצבת מוטות אוזניים עדינים לתוך האוזניים ואת השיניים העליונות הקדמיות לתוך מוט החותכת. הניחו את חרוט האף מעל האף לצורך הרדמה נכונה. יש לוודא שהראש מפולס וממורכז ולא ניתן להזיז אותו כאשר בוחנים אותו מעט.
- תת עורית להזריק 0.5 מ"ל של נורמוזול עבור הידרציה.
- יש למרוח חומר סיכה עיני למניעת התייבשות הקרנית.
- עקוב אחר עומק ההרדמה על ידי היעדר רפלקס הנסיגה לאחר צביטת בוהן בגפה האחורית, ולאחר מכן הפחת איזופלורן ל 1.5%-2.0% במהלך הניתוח.
- הסר שיער באזור הניתוח ובסביבתו על ידי מריטה או באמצעות קוצץ (גילוח) או קרם depilatory ולחטא את העור עם שלושה מחזורים של יישום לסירוגין של יוד ואתנול, גימור עם יוד. הסרת שיער מאתר הניתוח מומלצת רק אם יש אמצעים לשמור על הרדמה באותו מקום. במידת הצורך, השתמשו באפליקטורים של קצה כותנה טבולים באלכוהול כדי להסיר שיער מהאזור הקרוב סביב הראש. להזריק 0.05 מ"ל של משכך כאבים מקומי bupivacaine (0.25%) תת עורית.
- בצע חתך על הגולגולת באמצעות אזמל, ולאחר מכן לחתוך חלק של העור עם מספריים כירורגיים חדים, לחשוף את הגולגולת. דוחפים את העור הצידה, באמצעות צמר גפן, מנקים את הגולגולת מכל השרירים והרקמות שמתחתיה וחוסמים את הראייה.
הערה: כדי לעצור דימום בשוגג, יש להפעיל לחץ על אתר הדימום בעזרת צמר גפן סטרילי עד להפסקתו.
- נקו את הגולגולת במי חמצן באמצעות צמר גפן סטרילי כדי להפוך את תפרי הגולגולת ואת הברגמה והלמבדה לגלויים.
- יבשו היטב את הגולגולת, ולאחר מכן מרחו טיפה אחת של דבק דנטלי לחריטה עצמית באמצעות המוליך שלו. יש להבריש אותו לתוך הגולגולת, להמתין 60 שניות ולרפא עם אור UV דנטלי למשך 40 שניות. משטח מבריק מצביע על כך שהדבק הוצלב ביעילות עם הגולגולת.
הערה: שלב זה הוא קריטי לחיבור מאובטח של האוזנייה.
- השתמש במקדח בקוטר 0.031 אינץ' (0.79 מ"מ) כדי לקדוח שני חורי בור דו-צדדיים להשתלת אלקטרודות עומק בהיפוקמפוס (כ-5,000 סל"ד). קדח חור בור אחד נוסף עבור אלקטרודת הייחוס מעל המוח הקטן מאחורי lambda.
הערה: בעת הקידוח, יש להקפיד להוריד את המקדחה לאט ולהימנע מקידוח לתוך המוח.
- הקואורדינטות עבור האלקטרודות הן כדלקמן (מברגמה במ"מ): אלקטרודות היפוקמפוס בעומק 3 מ"מ אחורי, 3 מ"מ רוחבי ו-3 מ"מ עומק; ואלקטרודת ייחוס צרבלרית בעומק 6 מ"מ אחורית, 0 מ"מ לרוחב ו-0 מ"מ עומק (תת-דורלית).
- כדי להגדיל את הדיוק, השתמש מקדחה רכוב סטריאוטקסית, אפס את ציר מניפולטור סטריאוטקסי X / Y כאשר נוגעים bregma - זוהי נקודת ההתייחסות עבור הקואורדינטות.
- הרכיבו אוזניות על ידי הכנסת כל האלקטרודות למעמד של שישה פינים, וודאו שהפינים נדחפים כל הדרך אל הדום. הרכיבו את הכן לתוך מחזיק האלקטרודות על מסגרת סטריאוטקסית (איור 1B).
- יישר אלקטרודות מעל חורי הבור המתאימים. השתלה סטריאוטקסית של אלקטרודות תיל דו-קוטביות מעוותות מפלדת אל-חלד בהיפוקמפוס הימני והשמאלי ואלקטרודת ייחוס לתוך המוח הקטן על ידי הנמכה איטית של האוזניות והנחיית האלקטרודות לתוך חורי הבור.
- כאשר אלקטרודת פיתול ההיפוקמפוס נמצאת ממש מעל החור, אפסו את ציר Z והורידו לאט לאט ל-3.0 מ"מ.
- מכסים את משטח הגולגולת והאלקטרודות במלט דנטלי וממלאים את החלל שבין משטח הגולגולת לתחתית הדום. קצוות העור יהיו צמודים לצמנט הדנטלי כך שאף רקמה תחתיו לא תישאר חשופה. מחכים שהמלט יתייבש ויתקשה. לאחר מכן נתק את מחזיק האלקטרודה מהזרוע הסטריאוטקסית והסר את המחזיק מהכן.
- להזריק 0.1 מ"ל של ketoprofen (1 מ"ג / מ"ל, תת עורית [SC]) עבור שיכוך כאבים ומנה שנייה של 0.5 מ"ל של נורמוזול (SC) עבור הידרציה ולהסיר את החיה מן המסגרת סטריאוטקסית.
- הניחו פד איזותרמי שחומם מראש ל-37°C בתוך כלוב ויבריום ריק מכוסה במגבת נייר. ברגע שהוא ער לחלוטין, הניחו את בעל החיים בכלוב נקי עם מצעים ומזון רך, והחזירו אותו לוויבריום. בעלי חיים שוכנים בנפרד מנקודה זו ואילך כדי למנוע לעיסה זה של אוזניות של זה. לא משתמשים במוטות תיל כדי למנוע מהאוזניות להיתקע, ובמקום זאת, בקבוקי מים קשורים לחלק התחתון של צמרות הכלוב, וצ'או נמצא במצעים.
- האכילו את בעל החיים במזון רך במשך 72 שעות לאחר הניתוח ועקבו אחר ירידה במשקל וציון מצב הגוף. בעלי חיים מיובשים עשויים להיות מנוהלים 0.5 מ"ל של נורמוסול תת עורית אם מיובשים (ירידה במשקל, טורגור עור מוגבר, עיניים שקועות). קטופרופן יכול להינתן תת עורית פעם ביום במשך יומיים נוספים לאחר הניתוח (עקוב אחר משטר שיכוך כאבים על פי הנחיות הוועדה המוסדית המקומית לטיפול ושימוש בבעלי חיים [IACUC]. לאפשר לבעלי חיים להתאושש באופן מלא בכלובים שלהם במשך 4-7 ימים לפני העברתם למערכת ההקלטה אלקטרואנצפלוגרפיה (EEG).
