השפעת גירוי זרם ישיר על התקפים אפילפטיים מעוררים בפרוסות מוח עכבר

תקציר

מקור: Lu, H., et al. גירוי זרם ישר ורישום מערך רב אלקטרודות של פעילות דמוית התקף בהכנת פרוסת מוח של עכברים. J. Vis. Exp. (2016)

הסרטון מדגים מחקר להערכת ההשפעה של גירוי זרם ישיר (DCS) על התקפים אפילפטיים בפרוסות מוח של עכברים. פרוסות המוח המכילות את אזורי התלמוס המדיאלי המחובר (MT) ופיתול החגורה הקדמי (ACC) ממוקמות במערך רב-אלקטרודות (MEA). גירויים חשמליים ל- MT ותרופות הגורמות להתקפים מוחלים כדי לגרום להתקפים אפילפטיים ב- ACC. DCS מוחל לאחר מכן כדי להעריך את השפעתו על התקפים מעוררים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. הכנת פתרון ניסיוני וציוד להקלטת מערך ריבוי אלקטרודות

1. הכן נוזל שדרה מוחי מלאכותי (נוזל מוחי מלאכותי [aCSF]; 124 mM NaCl, 4.4 mM KCl, 1 mM NaH₂PO₃, 2 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 25 mM NaHCO₃ ו- 10 mM גלוקוז, מבעבע עם 95% O₂ ו- 5% CO₂).
2. השתמש בשני סוגים של בדיקות MEA: 6 x 10 מישורי MEA ו- 8 x 8 MEA. הגשושית הראשונה מכסה את האזור הכולל את קליפת המוח, הסטריאטום והתלמוס. הבדיקה האחרונה מכסה רק את האזור קליפת המוח.
3. השתמש במגבר של 60 ערוצים עם מסנן פס המוגדר בין 0.1 הרץ ל- 3 קילוהרץ בהגברה של 1,200. קבל נתונים בקצב דגימה של 10 kHz.
4. הניחו שני חוטי כסף מצופים AgCl בתוך תא MEA עבור DCS. השתמש בחוטי הכסף המצופים ב- AgCl כדי לייצר שדות חשמליים הנוצרים על ידי ממריץ מבודד.
5. הניחו אלקטרודת טונגסטן (קוטר, 127 מיקרומטר; אורך, 7.62 ס"מ; קצה מחודד 8° AC; התנגדות, 5 MΩ) לגירוי תלמי, והניחו את אלקטרודת הייחוס בתא MEA. העבר את זרמי אלקטרודת הטונגסטן באמצעות ממריץ מבודד הנשלט על ידי מחולל פולסים.

2. הכנת פרוסת המוח

1. יש להשתמש בעכברי C57BL/6J זכרים, בני 4-8 שבועות. שכן את בעלי החיים בחדר ממוזג (21-23 מעלות צלזיוס; 50% לחות; 12 שעות / 12 שעות מחזור אור/חושך, אורות דולקים בשעה 08:00) עם גישה חופשית למזון ומים.
2. קח aliquot 250 מ"ל של aCSF שהוכן בשלב 1.1 ומניחים אותו בתוך המכילה קרח. במקביל, לספק גז רציף המורכב 95% O₂ ו 5% CO₂.
3. כירורגיה
   1. מרדימים את בעל החיים עם 4% איזופלורן בקופסת זכוכית למשך כ-3 דקות. ברגע שהחיה מגיעה לעומק כירורגי של הרדמה (המסומן על ידי חוסר תגובה לצביטת בוהן), הניחו אותה על מגש רדוד מלא בקרח כתוש, והסירו את הראש באמצעות מספריים.
   2. חושפים את הגולגולת, וחותכים את השריר שנותר. לאחר מכן, באמצעות rongeurs, לקלף את פני השטח הגבי של הגולגולת מן המוח. חותכים את צידי הגולגולת באמצעות רונגורים. לעקר את כל כלי הניתוח בתמיסת אתנול 75%.
   3. באמצעות מרית, לחתוך את פקעות הריח ואת הקשרים העצביים לאורך פני השטח הגחוני של המוח, ולהסיר את המוח. לאחר עריפת ראש, העבירו במהירות את המוח לכוס מלאה ב-aCSF מחומצן קר כקרח.
4. הכנת MT-ACC Brain Slice
   הערה: הכינו פרוסות המכילות את המסלול מה- MT ל- ACC.
   1. חתכו ביד את גוש המוח עם שני חתכים סגיטליים 2.0 מ"מ לרוחב לקו האמצע בכל חצי כדור כדי להציג את האנטומיה התת-קליפתית. לאחר מכן בצע שני חתכים זוויתיים. בצע את החתך הצולב, הראשון במקביל למערכת הסיבים הנראית לעין בסטריאטום.
   2. בצע את החתך השני מהחיבור בין המוח הקטן לקליפת המוח הראייתית לנקודת האמצע בין הקומיסורה הקדמית לבין מערכת הראייה שהם גחונים ומקבילים למסלול התלמוסינגולאט.
   3. חבר את בלוק המוח לצלחת זוויתית (~ 120 °) עם דבק ציאנואקרילט ובצע חתך ממש מעל נקודת המפנה של המסלול. פתחו את הצלחת, שטחו אותה והדביקו אותה על במת התא של הוויברטום.
   4. הכינו פרוסות מוח תלמוס-ACC מדיאליות (בעובי 500 מיקרומטר) ולאחר מכן טבלו אותן ב-aCSF מחומצן קר כקרח. העבירו את הפרוסות לתא ההקלטה ושמרו בטמפרטורה של 32°C תחת זילוח רציף (12 מ"ל/דקה) עם aCSF מחומצן למשך שעה.

3. הכנת תא זילוח להקלטת מערך ריבוי אלקטרודות

1. הכנת תא זילוח
   1. הניחו בדיקת MEA על מערכת רב-ערוצית והשתמשו בשתי שפופרות פוליאתילן נפרדות כדי לחבר את הגשושית למשאבה פריסטלטית. השתמש בצינור אחד כדי להנחות את ה- aCSF לתוך תא MEA ובצינור השני כדי להנחות את ה- aCSF אל מחוץ לתא. לבסוף, יש לנקב ברציפות את התכשיר עם aCSF מחומצן חם (29-30 מעלות צלזיוס) (8 מ"ל/דקה).
2. העבירו את פרוסת המוח ל-MEA. החזיקו את פרוסת המוח באזור המזרח התיכון וצפון אפריקה בעזרת צמר גפן רטוב. הזיזו בזהירות את פרוסת המוח כדי לוודא שה-ACC מכוון מעל האלקטרודות.
3. השתמשו בערכות עיגון פרוסות ובהחזקות כדי ללחוץ על פרוסת המוח. שלב זה מבטיח חיבור חשמלי טוב בין הפרוסה לאלקטרודות.

4. יצירת שדות חשמליים על ידי DCS

הערה: הגדרת כיוון השדה החשמלי התבססה על כיוון הציר האקסודנדריטי ב-ACC. האוריינטציה של תאי דנדריט וסומה אושרה באמצעות צביעת גולג'י.

1. מקם את אלקטרודת AgCl (המוגדרת כאנודה) פרוקסימלית ל- ACC ומקם את האלקטרודה השנייה (המוגדרת כקתודה) דיסטלית ל- ACC. רשום את עוצמת השדה הנוצרת על ידי שני כיווני השדה (מקבילים ומאונכים לסיבים האקסודנדריטיים ACC) על ידי MEA, והעבר את זרמי השדות החשמליים באמצעות מגרה.
2. תקן את המרחק של אלקטרודות AgCl (כ 1.5-2 ס"מ) וכוונן את עוצמת הזרם של הממריץ כדי להפוך את DCS בין 0.5 ל 2 mA.

5. תגובות סינפטיות קורטיקליות המושרות חשמלית

הערה: השראת תגובות סינפטיות ב-ACC על ידי גירוי חשמלי ב-MT, שבו מחולל גירוי חשמלי הניתן לתכנות מייצר פולסי זרם דו-פאזי מלבניים.

1. חזור על סעיף 3 לעיל.
2. מניחים אלקטרודת טונגסטן ב- MT ומעבירים פולסים מהממריץ לאזור התלמי של הפרוסות באמצעות אלקטרודות טונגסטן דו קוטביות.
3. השתמש בעוצמות זרם שונות כדי לקבוע את הסף שמעורר תגובת ACC. כאן, השתמשו בעוצמה של ±150 μA ומשך של 200 μsec, מה שעורר תגובה מקסימלית של 80% ב-ACC ברוב הפרוסות.
4. הזז את אלקטרודת הטונגסטן לאורך מסלול התלמוסינגולטים (מ- MT ל- corpus callosum) בפרוסה MT-ACC כדי לקבל את פרופילי התגובה האופטימליים.
5. בצע 10-20 טאטוא של תגובות ACC והשתמש בתוכנה כדי לחשב ממוצע אוטומטי של כל ה- ACC המתעורר על ידי גירוי MT. התוצאה היא התגובות הסינפטיות ב-ACC המושרות מגירוי MT על ידי מסלול MT-ACC.

6. פעילות דמוית התקף המושרה חשמלית

הערה: פעילות דמוית התקף נגרמה על ידי יישום של 4-aminopyridine (4-AP; 250 μM) ו bicuculline (5 μM). מחקרי בקרת זמן קודמים הראו כי תגובות מקסימליות ויציבות הופיעו 2-3 שעות לאחר השימוש בתרופה.

1. חזור על סעיף 5 לעיל.
2. הוסף תרופות לתמיסת הזילוח. יש להשתמש ב-4-AP (250 מיקרומטר) וב-bicuculline (5 μM). מערבבים את התרופות באופן אחיד, וממשיכים בזילוח במשך 2-3 שעות.
3. כדי להקל על פעילות דמוית התקף, שמרו על משאבת הזילוח בקצב זילוח מהיר יחסית (8 מ"ל/דקה), מה שיכול גם לסייע במניעת הצטברות שיפוע pH.
4. מקם אלקטרודת טונגסטן ב- MT, וספק גירוי חשמלי (150 μA, משך 200 מיקרו-שניות) כדי לקבל פרופילי תגובת ACC.
5. בצע 10-20 טאטוא וממוצע התגובות.
6. החלף את תמיסת הזילוח ב- aCSF טרי כדי לשטוף את התרופות. חזור על שלב 6.5.

7. בדיקת ההשפעה של DCS על תגובות קורטיקליות מעוררות

1. חזור על סעיפים 3 ו-4. ודא ששדות חשמליים אחידים נוצרים על ידי העברת זרמים בין שני חוטי כסף מקבילים מצופים AgCl הממוקמים בתוך תא MEA. אם אין בעיות, DCS נשאר בין 0.5 ל 2 mA.
2. כבו את ה-DCS והניחו אלקטרודת טונגסטן כדי לעורר את התלמוס (±150 μA, 200 μsec duration). כדי לקבל תגובות סינפטיות מקסימליות ב- ACC, בצע 10-20 טאטוא וממוצע התגובות.
3. הפעל בו זמנית את DCS (עוצמת DCS של 2 mV/mm) ואת הגירוי התלמי (350 μA, משך 200 μsec). הערך את השינויים באמפליטודה של תגובת ACC המעוררת גירוי תלמי במהלך DCS.
4. כבה את DCS והוסף 4-AP (250 μM) ו- bicuculline (5 μM) לתמיסת הזילוח. לאחר מכן המתן 2-3 שעות. כאשר התרופות משפיעות על פרוסת המוח, הפרוסה מייצרת תגובות פרכוסיות בקליפת המוח.
5. בצע 10-20 טאטוא של תגובות ACC, ולאחר מכן מדוד את המשרעת ואת משך הזמן של תגובות התקפים קורטיקליים מעוררים חשמליים.
6. לאחר שלב 7.5, הפעל בו זמנית את DCS (עוצמת DCS של 2 mV/mm) ואת הגירוי התלמי (150 μA, 200 משך זמן μsec). להעריך שינויים באמפליטודה ובמשך של תגובות התקפים קליפת המוח במהלך יישום DCS.
7. החלף את תמיסת הזלוף ב- aCSF טרי כדי לשטוף את התרופות, וחזור על שלבים 7.2 ו- 7.3.
8. אסוף את כל נתוני ההקלטה וקבץ את הנתונים לתנאי הניסוי השונים. להעריך את המשרעת ואת משך התגובה להתקפים בקליפת המוח בתנאי ניסוי שונים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
הרדמה:
איזופלורן	תאגיד מוצרי Halocarbon	NDC 12164-002-25	4%
aCSF (סה"כ:1 L):
D(+)-גלוקוז	מרק	1.08337.1000	10 מ"מ
נתרן מימן פחמתי	מרק	1.06329.0500	25 מ"מ
נתרן כלורי	מרק	1.06404.1000	124 מ"מ
(+)-נתרן L-אסקורבט,>=98%	סיגמא	A4034-100G	0.15 גרם/2 צלזיוס
מגנזיום גופרתי, נטול מים, ReagentPlus	סיגמא	M7506-500G	2 מ"מ
סידן כלורי דיהידראט	מרק	1.02382.1000	2 מ"מ
נתרן דימימן פוספט מונוהידראט	מרק	1.06346.1000	1 מ"מ
אשלגן כלורי	מאי & בייקר בע"מ דאגנהאם, אנגליה	MS 7616	4.4 מ"מ
סמים:
(+)-Bicuculline	טוקריס	130	5 מיקרומטר ב- aCSF
4-אמינופירידין	טוקריס	940	250 מיקרומטר ב-aCSF
פרוסת מוח הכנה:
ויברטומה	ויברטומה	סדרה 1000	חוסמים את החיתוך לפרוסות בעובי 500 מיקרומטר
מערכת MEA:
בדיקות מערך מרובה אלקטרודות (MEA): 6 x 10 מישורי MEA	מערכות רב ערוציות	60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10	קוטר אלקטרודה, 30 מיקרומטר; מרווח בין אלקטרודות, 500 מיקרומטר; עכבה, 50 kΩ ב-200 הרץ
בדיקות מערך מרובה אלקטרודות (MEA): 8 x 8 MEA	איינדה ביוסיסטמס	60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8	אלקטרודה בצורת פירמידה; קוטר, 40 מיקרומטר; גובה קצה, 50 מיקרומטר; מרווח בין אלקטרודות, 200 מיקרומטר; עכבה, 1,000 kΩ ב-200 הרץ
שימוש במגבר של 60 ערוצים עם מסנן פס שהוגדר בין 0.1 הרץ ל-3 קילוהרץ בהגברה של 1,200X	מערכות רב ערוציות	MEA-1060-BC
תוכנת MC Rack בקצב דגימה של 10 KHz	מערכות רב ערוציות		תוכנה לאיסוף נתונים והקלטות
שליטה על מחולל דופק	מערכות רב ערוציות	STG 1002
פרוסות ערכות עיגון והחזקות	וורנר אינסטרומנטס	שד-26ח/10; WI64-0250
משאבה פריסטלטית מיניפולסים3	גילסום	MINIPULS3	קצב זילוח : 8 מ"ל/דקה
מערכת גירוי:
ממריץ מבודד	מערכות A-M	דגם 2100	עוצמה של ±350 μA , משך של 200 μsec
אלקטרודת טונגסטן	מערכות A-M	575300	ממוקם בתלמוס

נעשה