מיצוי חלבונים מתאי עצב

תקציר

מקור: שני, ט. ואח' Assay למדידת הובלה נוקלאוציטופלזמית בזמן אמת בתוך תאי NSC-34 דמויי נוירון מוטורי. J. Vis. Exp. (2017)

פרוטוקול זה מתאר את מיצוי החלבונים מתאי סרטן עצביים. התאים נשטפים בחיץ ועוברים שיבוש אנזימטי ומכני. הסופרנאטנט העשיר בחלבון המופק נאסף לאחר צנטריפוגה.

פרוטוקול

1. הכנת קו התא

1. הפשירו כ-1,000,000 תאי חוט שדרה נוירובלסטומה של עכברים (תאי NSC-34) שאוחסנו במיכל חנקן נוזלי. יש להשתמש באינקובטור מים בטמפרטורה של 37°C עד להפשרת התאים במלואה.
2. יש להוסיף מדיום טרי וחם (מדיום DMEM המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% L-גלוטמין ואנטיביוטיקה מסוג 1% דלקת עט).
3. צנטריפוגה הפשירה תאים (SL16R) ב 500 x גרם במשך 5 דקות, ויצרה גלולה התא. השליכו את המדיום והוסיפו 1 מ"ל של מדיום חדש לתרחיף התא.
4. מניחים את התאים המרחפים מחדש בבקבוק של 15 מ"ל ומוסיפים עוד 5 מ"ל של מדיום. לדגור את התאים לילה באינקובטור סטרילי עם 5% CO₂ ב 37 ° C.
5. במקביל, מניחים 8 כיסויים לא מצופים (זכוכית כיסוי: 12 מ"מ, 0.13-0.17 מ"מ עובי) בכלי תרבית של 60 מ"מ ומחטאים באמצעות 70% אתנול וחשיפה לאור UV של 30 דקות עד לייבוש. מוסיפים בינוני לכל תבשיל ומשליכים לשטוף את שאריות האתנול.
6. הוסף חיץ טריפסין (2.5 גרם טריפסין ו-0.2 גרם EDTA ב-1 ליטר של תמיסת מלח מאוזנת של הנקס) לתאים לאחר שהם מגיעים לכ-90% מפגש (כ-6 מיליון תאים בכל בקבוק) כדי לאפשר לתאים הדבקים להתנתק.
   הערה: תאי NSC-34 רגישים ודורשים רק 15 שניות של דגירה של חיץ טריפסין ודקה נוספת של דגירה ללא טריפסין לפני דיסוציאציה באמצעות המדיום.
7. מעבירים את התאים לצלחת תרבית בקוטר 60 מ"מ שכבר מכילה את הכיסויים עם 3 מ"ל בינוני, כ-350,000 למנה. השאירו אותם באינקובטור למשך 24 שעות כדי לאפשר חיבור תאים לכיסויים.

2. אימות ביטוי חלבונים

1. הניחו על קרח צלחות תרבית בקוטר 60 מ"מ המכילות את שאריות התאים (שלא שימשו בניסוי הנ"ל) מכל קבוצת ניסוי.
2. יש להשליך את המדיום ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS כדי לדלל ולשטוף את המדיום הנותר.
3. טפל בתאים עם 200-400 μL של חיץ ליזה המכיל PBS, 0.5% טריטון, וטבלית קוקטייל מעכב פרוטאז (PI). לגרד באמצעות מגרד תאים.
4. לאסוף את התאים בחיץ ליזיס בצינור מיקרוצנטריפוגה והומוגניזציה עם הומוגנייזר ב 4,000 סל"ד למשך דקה אחת מתחת לקרח.
5. צנטריפוגה של התאים ההומוגניים ב 2,500 x גרם במשך 10 דקות. לאסוף את supernatant, לכמת את ריכוז החלבון באמצעות מבחן ברדפורד, ולאחסן ב -20 ° C עד לשימוש.
6. אספו בין 30 ל-70 מיקרוגרם של חלבון כולל (תלוי בחלבון) וטענו אותו לג'ל SDS-PAGE כדי לבדוק את ביטוי החלבון באמצעות בדיקת אימונובלוט.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קו תאים היברידי דמוי נוירון דמוי תא עכבר (NSC-34)	Tebu-Bio	CLU140-A
DMEM 4.5g/L L-גלוקוז	תעשיות ביולוגיות	01-055-1א
FBS כיתה אירופית	תעשיות ביולוגיות	04-007-1א
SL 16R צנטריפוגה	תרמו סיינטיפיק	75004030
Thermo Forma Series II אינקובטור CO2 עם מעיל מים	תרמו סיינטיפיק	3111
זכוכית כיסוי בקוטר 12 מ"מ בעובי 0.13-0.17 מ"מ	בר נאור בע"מ
אקסיוברט 100 מיקרוסקופ הפוך	זיס
לפטומיצין ב	סיגמא	L2913
PBS	תעשיות ביולוגיות	02-023-1א
מנוע הומוגנייזר / שליטה / צ'אק / מהדק 90 מעלות	גלאס-קול	099C K5424CE
MicroCL 17R צנטריפוגה, בקירור	תרמו סיינטיפיק	75002455