1. קביעת ביטוי יחסי של חלבון על פני התא באסטרוציטים על ידי ביוטינילציה
הערה: במאמר זה אנו ממחישים את היישום של טכניקת ביוטינילציה זו לחקר ההשפעות של מולקולת המטריצה החוץ-תאית למינין על לוקליזציה של פני השטח של התעלה החדירה למים Aquaporin-4 (AQP4). חומרים מיוחדים הדרושים לבדיקה זו כוללים sulfo-NHS-LC-biotin (sulfosuccinimidyl 6-(biotinamido) Hexanoate) ושרף streptavidin-agarose (ראה טבלה של חומרים).
- באמצעות השיטה, להכין תרביות של אסטרוציטים קליפת המוח כשבועיים לפני הבדיקה, ולגדל אותם 75 ס"מ2 צלוחיות תרבית אוורור. כאשר אסטרוציטים הם 80 - 90% נפגשים, לנתק אותם מפני השטח של התרבית באמצעות 0.05% טריפסין, ולאחר מכן להעביר אותם 1: 3.
- ב-48 שעות לפני הבדיקה, כאשר התאים שוב נמצאים ב-80-90% במפגש, מעבירים אסטרוציטים 1:3 (בהתחשב בשינוי בפורמט התרבית) לצלחות תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ, כך שהן >70% נפגשות ביום שבו אמור להתבצע הניסוי. ודא כי התאים מפוזרים באופן שווה בין מנות.
- ב 16 שעות לפני הבדיקה, פיפטה למינין לתוך מדיום תרבית לריכוז סופי של 24 ננומטר, ולדגור ב 37 ° C.
- מיד לפני הבדיקה, הכינו את הדברים הבאים, ולאחר מכן הניחו על קרח או במקרר: CM-PBS (100 מ"ג/ליטר MgCl2∙6H2O ו-100 מ"ג/ליטר CaCl2 במי מלח חוצצי פוספט 1X [PBS], pH 7.4), מאגר ביוטין (0.5 מ"ג/מ"ל סולפו-NHS-LC-ביוטין ב-CM-PBS), חיץ מרווה (50 מ"מ NH4Cl ב-CM-PBS), חיץ ליזיס (25 mM Tris, pH 7.4, 25 mM גליצין, 150 mM NaCl ו-5 mM ethylenediaminetetraacetic acid [EDTA], 1% טריטון X-100, קוקטייל מעכב פרוטאז 1X), מאגר העמסה פי 3 (150 mM Tris, pH 6.8, 6% נתרן דודציל סולפט [SDS], 30% גליצרול, 300 mM dithiothreitol [DTT] ו-0.01% ברומופנול כחול), ומאגר כביסה (10 mM Tris (pH 7.4), 1.5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, קוקטייל מעכב פרוטאז 1X).
- מוציאים את הכלים המחזיקים את תרביות האסטרוציטים מהאינקובטור ומשליכים את המדיום.
- לשטוף תאים שלוש פעמים עם 4 מ"ל CM-PBS צונן ומניחים את הכלים על קרח כתוש.
- פיפטה 2 מ"ל ביוטין חוצצת לתוך כל באר, ובעדינות להטות כלים קדימה ואחורה כמה פעמים כדי להבטיח כיסוי מלא. השאירו על קרח למשך 30 דקות.
- הסר את מאגר הביוטין באמצעות שואב והחליף אותו במאגר מרווה 4 מ"ל. השאירו על קרח למשך 10 דקות.
- שאפו את מאגר המרווה והחליפו אותו בנפח שווה ערך של אותו דבר. שוב, להשאיר על קרח במשך 10 דקות.
- יש להשליך את מאגר המרווה ולשטוף תאים שלוש פעמים עם CM-PBS מקורר 4 מ"ל.
- מגרדים תאים לתוך 1 מ"ל CM-PBS מקורר באמצעות מרים תאים ומעבירים את המתלה לצינור מיקרוצנטריפוגה.
- תאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 100 x גרם במשך 3 דקות. להשליך את supernatant ו resuspend תאים ב 500 μL של חיץ ליזיס.
- השאירו דגימות על קרח למשך 30 דקות, מערבלים כל 5 דקות, או הניחו אותן על מסובב מקצה לקצה בטמפרטורה של 4°C.
- צנטריפוגו את הליזט בטמפרטורה של 14,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C כדי להוציא חומרים בלתי מסיסים בדטרגנט. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
- שמור 50 μL של lysate זה ולהוסיף מאגר העמסה אליו. ואז denature אותו על ידי חימום ב 95 °C באמבטיה יבשה; זהו חלק "הקלט", המכיל הן חלבונים biotinylated פני התא, כמו גם חלבונים cytosolic שאינם biotinylated.
- הרחבת פתח קצה פיפטה על ידי חיתוך כ-0.5 ס"מ של חומר מקצהו באמצעות זוג מספריים חדים. באמצעות קצה פיפטה זה, להעביר 75 μL של חרוזי סטרפטווידין-agarose (מאוחסן בדרך כלל ב 4 ° C) ליזט, ולדגור ב 4 ° C במשך 3 שעות על שייקר/נדנדה.
- כמו streptavidin-agarose נמכר לעתים קרובות כמו slurry המכיל 50% חרוזים על ידי נפח, מרחף בתמיסה מיקרוביאלית, triturate את slurry כדי להבטיח כי החרוזים הם מרחפים באופן שווה, ולאחר מכן פיפטה 150 μL של התרחיף לתוך כל דגימה.
- חרוזי סטרפטווידין-אגרוז גלולה על ידי צנטריפוגה ב 1500 x גרם במשך 30 s ב 4 °C (75 °F).
- חסוך 50 μL של supernatant (להוסיף חיץ העמסה ולנטרל אותו ב 95 ° C באמבט מים או בלוק חימום); זה מייצג את החלק "תוך תאי" והוא מורכב בעיקר חלבונים ציטוסוליים שאינם biotinylated.
- השהה מחדש את החרוזים הכדוריים בחיץ כביסה של 1 מ"ל, וניער אותו במשך 3 דקות ב -4 מעלות צלזיוס. חרוזי גלולה (כמו בשלב 1.16) והשליך את הסופרנטנט. חזור על תהליך זה 4x כדי למזער את הקישור הלא ספציפי של חלבונים ציטוסוליים שאינם ביוטינילטים.
- מטילים את החרוזים באמצעות צנטריפוגה (1500 x גרם למשך 30 שניות ב-4 מעלות צלזיוס) ומשליכים את חיץ הכביסה שמעליו. הוסף 50 μL של מאגר העמסה 1X (מדולל באמצעות מאגר ליזיס). שחררו ביוטין וסטרפטאווידין מחרוזים על ידי דנטורציה זו ב-95 מעלות צלזיוס; חלק זה צריך להכיל חלבונים ביו-טינילטיים בפני השטח של התא בלבד (מקטע "פני התא").
- הפרדת קלט, פני השטח של התא ושברים תוך-תאיים על-ידי SDS-PAGE (אלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד), וניתוח על-ידי Western Blotting.
הערה: בעוד שהשתמשנו בג'ל שיפוע פריקאסט 4-20% בניסויים שלנו, ג'ל הפרדה של 12-14% עם שכבת ערימה של 4% (כל אחת מכילה 0.1% SDS) אמור להספיק לחלבונים המעניינים במחקר זה. יש להשתמש גם בתקן משקל מולקולרי בטווח המידות המתאים. שימו לב שלפעמים יכולה להיות עלייה ניכרת במסות המולקולריות לכאורה של חלבונים ביוטינילטים.