$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.
1. קביעת קצב הפנמה של חלבוני פני התא באסטרוציטים על ידי ביוטינילציה
הערה: במאמר הבא אנו מתארים ניסוי טיפוסי של ביוטינילציה במרדף דופק המשמש במקרה זה למעקב אחר אנדוציטוזה של AQP4 באסטרוציטים. חומרים מיוחדים הדרושים כוללים sulfo-NHS-SS-biotin, שרף סטרפטווידין-אגרוז, גלוטתיון מופחת ויודואצטמיד (ראו טבלת חומרים).
- הכינו תרביות של אסטרוציטים קורטיקליים של עכברים בצלחות של 60 מ"מ בשיטות שתוארו בסעיף הקודם. ודא כי התאים הם כ 70% confluent ביום של הבדיקה וכי כל צלחת מכילה מספר שווה של תאים.
- מיד לפני הבדיקה, הכינו את הפריטים הבאים, והניחו על קרח או במקרר: CM-PBS או פוספט מלח חוצץ (100 מ"ג/ליטר MgCl2∙6H2O ו-100 מ"ג/ליטר CaCl2 ב-1X PBS, pH7.4), מאגר ביוטין (0.5 מ"ג/מ"ל סולפו-NHS-SS-ביוטין ב-CM-PBS), חיץ מפחית (50 מ"מ גלוטתיון מופחת, 75 מ"מ NaCl ו-75 מ"מ NaOH), מאגר מרווה (50 mM יודואצטמיד, 1% BSA, ב-CM-PBS), חיץ ליזיס (25 mM Tris, pH 7.4, 25 mM גליצין, 150 mM NaCl ו-5 mM EDTA או חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית, 1% טריטון X-100, קוקטייל מעכב פרוטאז 1X), מאגר העמסה פי 3 (150 mM Tris, pH 6.8, 6% SDS או נתרן דודציל סולפט, 30% גליצרול, 300 mM DTT או Dithiothreitol ו-0.01% ברומופנול כחול), וחיץ כביסה (10 mM Tris, pH 7.4, 1.5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% triton X-100, 1X קוקטייל מעכב פרוטאז).
- הכינו מדיום תרבית תאים טרי (מדיום הנשר המעובד של דולבקו; או DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-1% L-גלוטמין), והניחו אותו באמבט מים בטמפרטורה של 37°C.
- הוציאו תרביות אסטרוציטים מהאינקובטור, ושאפו את התווך באמצעות אספירטור.
- לשטוף תאים שלוש פעמים עם 4 מ"ל CM-PBS מקורר, ומניחים את הכלים על קרח כתוש.
- פיפטה 3 מ"ל ביוטין חוצצת לכל מנה, מטים כלים קדימה ואחורה כמה פעמים כדי להבטיח שהמאגר מפוזר היטב, ומשאירים על קרח למשך 30 דקות.
- שאפו חיץ ביוטין, והחליפו אותו בתווך חם 5 מ"ל. לדגור צלחת תרבית ב 37 ° C במשך 15 דקות, ומנה שנייה באותה טמפרטורה במשך 30 דקות. השאירו מנה נוספת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדגימה של 0 דקות.
- בסוף תקופת הדגירה, להשליך את המדיום ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם 4 מ"ל CM-PBS מקורר. פיפטה 6 מ"ל הפחתת חיץ מעל התאים ולהשאיר אותם על קרח במשך 15 דקות.
- הסר את מאגר ההפחתה והחלף אותו ב- 6 מ"ל של חיץ חיץ חיזור טרי. מניחים את התערובת על קרח למשך 15 דקות נוספות.
- הסר את תמיסת ההפחתה והחלף אותה במאגר מרווה 6 מ"ל. השאירו על קרח למשך 15 דקות.
- חזור על שלב המרווה פעם נוספת.
- יש להשליך את מאגר המרווה ולשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS מקורר 4 מ"ל.
- באמצעות מרים תאים, לגרד תאים לתוך 1 מ"ל PBS מקורר ולהעביר את המתלה לתוך צינור microcentrifuge.
- תאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 100 x גרם במשך 3 דקות. להשליך את supernatant, ולהשהות מחדש תאים ב 500 μL lysis buffer.
- השאירו את הדגימות על קרח למשך 30 דקות ומערבולות כל 5 דקות. לחלופין, הניחו את הדגימות על מסובב מקצה לקצה בטמפרטורה של 4°C למשך זמן זה.
- צנטריפוגה את הליזט ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי לגלול את החומרים המסיסים דטרגנט, ולאחר מכן להעביר את supernatant לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש. שמור 50 μL של lysate זה, להוסיף חיץ העמסה אליו, denature ב 95 ° C באמבטיה יבשה; זהו חלק "הקלט", המכיל הן חלבונים אנדוציטוזים biotinylated וחלבונים nonbiotinylated.
- בעזרת קצה פיפטה חתוך, מוסיפים 150 μL של תרחיף סטרפטווידין-אגרוז לליזט, ודגרים בטמפרטורה של 4°C למשך 3 שעות על שייקר/נדנדה.
- חרוזי סטרפטווידין-אגרוז גלולתיים על ידי צנטריפוגה ב 1,500 x גרם במשך 30 שניות ב 4 ° C.
- יש להשהות חרוזים ב-1 מ"ל, לשטוף את החיץ ולהתנדנד למשך 3 דקות ב-4°C. חרוזי גלולה (לפי שלב 1.18) ולהשליך את הסופרנטנט. חזור על תהליך זה 4 פעמים כדי למזער את הקישור הלא ספציפי של חלבונים ציטוסוליים שאינם ביוטינילטים.
- חרוזי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 1,500 x גרם במשך 30 שניות ב 4 ° C ולהשליך את חיץ הכביסה מעל. הוסף 50 μL 1X מאגר העמסה (מדולל באמצעות חיץ ליזיס). לשחרר ביוטין סטרפטאווידין מחרוזים על ידי denaturing ב 95 ° C; חלק זה צריך להכיל חלבונים מופנמים על פני התא בלבד (מקטע "אנדוציטוזי").
- קלט נפרד, פני התא ושברים לא קשורים על ידי אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד נתרן דודציל סולפט (SDS-PAGE), ונותחו על ידי Western Blotting.
הערה: בעוד שהשתמשנו בג'ל שיפוע פריקאסט 4-20% בניסויים שלנו, ג'ל הפרדה של 12-14% עם שכבת ערימה של 4% (כל אחת מכילה 0.1% SDS) אמור להספיק לחלבונים המעניינים במחקר זה. יש להשתמש גם בתקן משקל מולקולרי בטווח המידות המתאים. שימו לב שלפעמים יכולה להיות עלייה ניכרת במסות המולקולריות לכאורה של חלבונים ביוטינילטים.