$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת מטריצות
- מרתיחים 4-8 מטריצות סיליקון במיקרוגל או על פלטה חמה למשך 5 דקות ומניחים להן להתייבש לחלוטין למשך שעה תחת זרימה למינרית (צד מפוספס כלפי מעלה).
הערה: ההליכים הבאים צריכים להתבצע תחת זרימה למינרית.
- נשפו אוויר דחוס או השתמשו בסרט דביק שקוף כדי להסיר אבק מהצד המפוספס של המטריצות. שמרו על צד הפסים נקי כדי שיוכל להיצמד היטב למשטח הצלחת.
- מניחים בזהירות את המטריצות על כלי פלסטיק בקוטר 6 ס"מ על ידי לחיצה עם אצבע (מטריצה אחת לכל מנה; צד הפס כלפי מטה). הימנעו מקבלת בועות אוויר בין המטריצה לצלחת. סמנו את מיקום הפסים בצד התחתון של צלחת התרבות.
- אם המטריצה אינה מצליחה להתחבר, חזור על הפעולה משלב 1.2.
2. יצירת פסים וציפוי למינין לתרבית נוירונים
- הכינו חלבון רקומביננטי מסומן פלואורסצנטית (25 מיקרוליטר כל אחד להזרקה [שלב 2.2] או 100 מיקרוליטר כל אחד לשיטת המיקום [שלב 2.2.1]) על ידי ערבוב חלבון Fc מתויג (10-50 מיקרוגרם/מ"ל) ונוגדן Fc אנטי-אנושי מצומד בצבע פלואורסצנטי (יחס 1 עד 3: 30-150 מיקרוגרם/מ"ל) במי מלח חוצצים פוספט (PBS). לאחר מכן, לדגור על התערובת במשך 30 דקות ב RT.
- באמצעות מזרק 22-G, הזריקו 25 μl של החלבון הרקומביננטי שהוכן בשלב הקודם (2.1) דרך החור הקטן בצד המטריצה (חיצים באיור 1A, 1C ו-1E).
- לחלופין, הניחו 100 μl של החלבון הרקומביננטי לתוך החריץ העליון של המטריצה ושאפו כמחצית מהתמיסה מהחור הקטן (החיצים באיור 1A, 1C ו-1E), כך שהחלבון הרקומביננטי יישאר באזורים המפוספסים.
- לדגור על המנה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית תאים.
- הכניסו 300 μl של PBS לחריץ העליון (איור 1B) ושאפו מהחור הקטן שנמצא בצד המטריצה (החיצים באיור 1A, C ו-E) כדי להסיר חלבונים רקומביננטיים לא מחוברים. אין לשאוף את PBS לחלוטין, כי החלבונים יתייבשו. חזור על שלב זה פעמיים. (פי 3 סה"כ)
- בזהירות להסיר את המטריצה ומיד להניח ~ 100 μl של חלבון בקרה (10-50 מיקרוגרם / מ"ל; Fc) כדי לכסות את כל שטח הפסים, יצירת ציפוי חלופי. לאחר מכן, לדגור על המנה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית התא.
- לאחר שטיפת משטח הכלים שלוש פעמים עם PBS, צפו אותו ב~ 100 μl של 20 מיקרוגרם / מ"ל למינין ב- PBS.
הערה: למינין צריך להיות מופשר על קרח כדי למנוע התמצקות.
- לדגור על המנה במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית התא.
- שטפו את משטח הכלים שלוש פעמים עם PBS והוסיפו מדיום תרבית. מניחים את התבשיל המצופה בתרבית מדיום באינקובטור 5% CO2 בטמפרטורה של 37°C עד לשימוש.
3. גידול נוירונים בהיפוקמפוס מעוברי עכבר E15.5
- יש להרדים את האם באמצעות פריקת צוואר הרחם ולבודד שלושה עוברים מסוג E15.5.
- חותכים את העור והגולגולת בקו האמצע של הראש עם מספריים, ולהסיר את המוח באמצעות כף קטנה. העבירו את המוח בזהירות לצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ המכילה 3 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS).
- בעזרת אזמל חתכו החוצה את ההמיספרות כולל קליפת המוח, ההיפוקמפוס והסטריאטום (איור 2A). לאחר מכן, נתחו את אזור ההיפוקמפוס על-ידי הסרה זהירה של קרומי המוח, והעבירו את רקמות ההיפוקמפוס המנותחות לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל של תמיסת HBSS, על קרח (איור 2B-C). לאסוף 6 hippocampi מ 3 עוברים בצינור, אשר מספיקים לטיפוח נוירונים ב 8 מנות.
- החלף את תמיסת HBSS בתמיסת טריפסין/אתילאנדיאמין חומצה טטראצטית (טריפסין/EDTA) (2 מ"ל) ודגר על הצינור בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות באמבט מים.
הערה: יש לשאוף HBSS ללא צנטריפוגה ואין לרוקן את תמיסת HBSS על ידי הטיית הצינור.
- נטרל את פעילות הטריפסין על ידי הוספת 500 μl של סרום בקר עוברי (FBS).
- צנטריפוגה את התערובת ב 100 x גרם במשך 5 דקות. מוציאים את הסופרנאטנט ושוטפים את הגלולה עם 2 מ"ל של מדיום תרבית. חזור על שלב זה פעם נוספת.
- פיטום ההיפוקמפוס למעלה ולמטה 10 פעמים במדיום תרבית באמצעות קצה של 1,000 μl עם חור גדול (cut-tip) כדי לנתק את הרקמה.
- החליפו לקצה רגיל (לא חתוך) של 1,000 מיקרוליטר וזרמו את הרקמה המנותקת מעלה ומטה לקבלת תרחיף חד-תאי.
- הפרד את התאים הבודדים על ידי העברתם דרך מסננת תאי רשת של 80-100 מיקרומטר.
- צנטריפוגה את המתלה החד-תאי המסונן במהירות של 150 x גרם למשך 5 דקות.
- הסר את supernatant על ידי שאיפה, ו resuspend את הגלולה (נוירונים) ב 2 מ"ל של מדיום תרבית.
- ספור את התאים באמצעות hemocytometer עם צביעה כחולה trypan כדי לקבוע את הצפיפות ואת הכדאיות. לאחר מכן, צלחת 10,000 נוירונים ב 150 μl של מדיום תרבית עבור כל קבוצה של פסים. המתלה צריך להיות ממוקם בזהירות כדי לכסות את כל אזור הפס.
