העברת פגיעה מוחית טראומטית במוח עכבר

תקציר

מקור: Zhong, J., et al. הדמיה תוך חיונית של ביטוי חלבון פלואורסצנטי בעכברים עם פגיעה מוחית טראומטית בגולגולת סגורה וחלון גולגולת באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים. J. Vis. Exp. (2023)

סרטון זה מדגים העברה של פגיעה מוחית טראומטית (TBI) בעכברים. לאחר חשיפת הגולגולת, אתר TBI מסומן. לאחר מכן העכבר ממוקם מתחת להתקן TBI. הפגיעה מועברת על ידי הרמת מוט המתכת ומאפשרת לו ליפול בחופשיות על המשפיע, שנמצא במגע עם הגולגולת.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. מתן אינדוקציה של פגיעה מוחית טראומטית חוזרת (TBI)

NOTE: פרמטרי TBI מותאמים מדוחות קודמים, שבהם השפעת TBI נמסרה פעם אחת. הפרוטוקול כאן מחיל את אותו פרמטר, למעט הגדלת מספר ההשפעה הכולל ל -10.

1. ציוד TBI
   1. השתמשו במכשיר נייד שנבנה במיוחד כדי לנהל TBI עם גולגולת סגורה (איור 1A) לראש העכבר בצד ימין, כפי שמצוין באיור 1B.
2. הכנה לפני ניתוח
   1. ציוד לניתוחי אוטוקלאב, כולל מספריים רגילים, קליפר כירורגי, מספריים קפיציים כירורגיים, מלקחיים כירורגיים, מלקחיים נגד יתושים, חתיכות עמוד ראש, גזה ומוליכי כותנה.
   2. לשקול ולרשום את משקל הגוף של העכבר 2 שעות לפני הניתוח. כדי למזער בצקת במוח במהלך השתלת חלון גולגולתי, הזריקו דקסמטזון נתרן פוספט במינון של 4.8 מ"ג/ק"ג [2 מ"ג/מ"ל, בדרך כלל ~70 מיקרוליטר (צריך להזריק בשני אתרים)] לשריר הארבע ראשי באמצעות מזרק אינסולין. לאחר הזרקת דקסמתזון, אך לפני תחילת ניתוח TBI, הכינו את חלונות הזכוכית כפי שמצוין בשלב 2.1 לשימוש מאוחר יותר.
   3. יש לחטא את השלב הכירורגי ואת ציוד ה-TBI באמצעות אתנול 75%. הרחיבו את הווילונות הכירורגיים הסטריליים החד פעמיים כדי לכסות את שלב הניתוח על הפלטפורמה הסטריאוטקסית. הפעל את מכשיר החימום ואת צג הטמפרטורה וקבע את טמפרטורת היעד ל -37 מעלות צלזיוס.
   4. פתח את שסתום מיכל החמצן וכוונן את זרימת החמצן ל- 1.5 ליטר לדקה. פתח את מכונת ההרדמה והגדר את ערך רמת האיזופלורן ל- three.
      הערה: 100% חמצן טהור יכול לעזור לחיה לשרוד את השפעות TBI.
   5. הניחו את העכבר בתא האינדוקציה ותנו לו להישאר במשך 5 דקות כדי להשיג הרדמה מלאה.
   6. לאחר שהעכבר מורדם לחלוטין (כלומר, קצב נשימה איטי אך יציב בערך מחזור אחד לכל 2 שניות, יחד עם היעדר רפלקס צביטת זנב), הסר את העכבר מתא ההשראה והנח את ראש העכבר במסגרת הסטריאוטקסית.
   7. הניחו את חרוט האף של צינור ההרדמה מעל חוטמו של העכבר.
   8. יש להקפיד על הרדמה באמצעות 1.5% איזופלורן מעורבב עם 100% חמצן טהור בקצב זרימה של 1 ליטר/דקה עד סוף הניתוח. בדוק מעת לעת את תדירות הנשימה וספק צביטת זנב או בוהן לפחות כל 15 דקות במהלך הניתוח כדי להעריך הרדמה מתאימה. התאם את ריכוז האיזופלורן לפי הצורך כדי לשמור על עומק ההרדמה הרצוי.
3. ניתוח TBI
   1. יש לתת בופרנורפין (1 מ"ג/ק"ג, תת עורית) באמצעות מזרקי אינסולין חד פעמיים ולמרוח משחה אופתלמית על עיני העכבר.
   2. הסר את השיער מהחלק העליון של הראש על ידי גזיזתו עם מספריים 1 ולאחר מכן מריחת חומר depilatory במשך 1 min.
      אזהרה: אין למרוח את המוצר מסיר השיער במשך יותר מ-3 דקות על הקרקפת, מכיוון שהוא מגרה את העור. כמו כן, הימנע מקבל כל סוכן depilatory לתוך העיניים של העכבר.
   3. נקו את עור הקרקפת על ידי מריחת גזה ואפליקטורים עם קצוות כותנה. לאחר מכן, לחטא את העור, באמצעות אתנול 75% תחילה ולאחר מכן betadine. חזור על פעולה זו שלוש פעמים (כלומר, אתנול ואחריו betadine), משאיר את היישום הסופי של betadine על העור.
   4. בדוק שוב את עומק ההרדמה כדי לוודא שהעכבר מורדם לחלוטין (כלומר, קצב נשימה איטי אך יציב בערך מחזור אחד לכל 2 שניות, יחד עם היעדר רפלקס צביטת זנב). מלקחיים את העור במלקחיים כירורגיים 3 ומבצעים חתך בקו האמצע באורך 12-15 מ"מ החל מכ-3 מ"מ אחורי מהעיניים.
   5. הבלו את העור על ההמיספרה השמאלית והימנית של הגולגולת באמצעות מספריים קפיץ 2.
   6. לאחר חשיפת הגולגולת, הסירו את הפריאוסטאום על ידי שפשוף עדין עם מוליך סטרילי עם כותנה ושטיפתו במי מלח סטריליים.
   7. בדוק חזותית את מצב הגולגולת כדי לוודא שהיא שלמה, למעט שני החורים הקטנים, שנעשו עבור ניתוח הזרקת הנגיף הקודם.
   8. יבשו את אזור הגולגולת וסמנו את אתר הפגיעה ב-TBI בקואורדינטות הבאות: 2.5 מ"מ אחורי לברגמה ו-2 מ"מ רוחבי מתפר הקשת מימין (איור 1B).
   9. הסר במהירות את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית והנח את הראש על כרית החיץ מתחת להתקן TBI.
   10. ישר את קצה המשפיע לאתר ההשפעה המסומן.
   11. הרימו את עמוד המתכת על ידי משיכת חוט הניילון הקשור 15 ס"מ מעל ראש העכבר ואז שחררו אותו, מה שמאפשר למשקולת ליפול בחופשיות על מוט המתמר, שנמצא במגע עם ראש הגולגולת באתר TBI. אל תיגע בראש העכבר בעת פגיעת TBI.
   12. העבירו את העכבר על שמיכת החימום והניחו אותו על גבו תוך מעקב אחר מצב הנשימה.
   13. ברגע שהעכבר מעביר את עצמו ממצב שכיבה למצב נוטה, מקם אותו בתא השראת איזופלורן למשך ~5 דקות עם 3% איזופלורן מעורבב עם 100% חמצן טהור בקצב זרימה של 1.5 ליטר לדקה.
   14. ברגע שהעכבר מורדם לחלוטין (כלומר, קצב נשימה איטי אך יציב בערך מחזור אחד לכל 2 שניות, יחד עם היעדר רפלקס צביטת זנב), חזור על שלבים 1.3.9-1.3.14 כדי להשיג סך של 10 פגיעות.
       הערה: עשר פגיעות TBI נמצאו כגורמות לפנוטיפ חזק עם תמותת עכברים נמוכה במחקר שלנו (נתונים שעדיין לא פורסמו). ניתן להתאים את הפרמטרים כדי להשיג חומרה שונה של פגיעה מוחית על ידי הגדלה או הקטנה של מספר הפגיעות ו / או הגובה שממנו המשקל משתחרר. כל הפרמטרים כפופים לאישור IACUC המקומי.
   15. בדוק את הגולגולת תחת מיקרוסקופ כירורגי והסר את העכבר מהמחקר אם התרחש שבר בגולגולת.
   16. עבור ניתוחי דמה, בצע את אותם הליכים שתוארו לעיל, כולל הנחת בעל החיים מתחת לגורם המשפיע אך מבלי לספק את ההשפעות של TBI.
   17. לאחר שהעכבר מעביר את עצמו ממצב שכיבה למצב נוטה בעקבות פגיעת TBI העשירית, הניחו אותו בתא ההשראה של איזופלורן למשך ~5 דקות. לאחר מכן, בצע את השלבים 1.2.6-1.2.8 כדי למקם את ראש העכבר על המסגרת הסטריאוטקסית עבור ניתוח השתלת חלון הגולגולת המתואר להלן.

תוצאות

איור 1: דיאגרמות עבור התקן TBI, אתר פגיעה ב-TBI והכנת חלונות. (A) ציוד להתקן TBI לירידה במשקל. 1: כן, 2: סוגר, 3: מהדק מתכוונן, 4: חוט ניילון, 5: מנהרת הטלת משקל, 6: עמוד משקל מתכתי (50 גרם), 7: משפיע, 8: כרית חיץ. (B) סכמה של הזרקת הנגיף ואתר פגיעת TBI, כאשר הקואורדינטות 2.5 מ"מ אחוריות לברגמה ו-2 מ"מ לרוחב מתפר הקשת מימין. (ג) סכמה להכנת חלון הזכוכית. שני כיסויי זכוכית בקוטר 3 מ"מ ו-5 מ"מ משולבים ב...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מברשות אפליקטור מדויקות מתכווננות	פרקל	S379
מזרק אינסולין BD	ב.ד.	NDC/HRI#08290-3284-38	5/16 אינץ' x 31G
בטדין	פרדו	NDC67618-151-17	כולל 7.5% יוד פובידון
בופרנורפין	PAR פרמצבטיקה	NDC 42023-179-05
אנונימי	פישר סיינטיפיק	04355223EA	75%
מערכת חימום	CWE	עכבר TC-1000	מצויד במכשיר סטריאוטקסי וישמש בעת ניתוח
שמיכת חימום	בית מרקחת CVS	E12107	מכשיר חימום נוסף לשימוש לאחר הניתוח
משחת עיניים סיכה	פיקטל	NDC 46066-753-55
עט טוש	דלאסקו	SMP-BK
מלקחיים נגד יתושים	קרוליינה	פריט #:625314	פלדת אל-חלד, מעוגלת, 5 אינץ'
סוכן Depilatory	תאגיד McKesson	לא ישים	Nair, תחליב להסרת שיער אלוורה ולנולין
מספריים רגילים 1	יורוסטאט	Eurostat ES5-300
מספריים רגילים 2	מכשירים מדויקים בעולם	מס' קטלוגי 501759-G
מלוחים	עולם ביולוגי	L19102411PR
מספריים קפיץ 1	מכשירים מדויקים בעולם	מס' 91500-09	טיפ ישר
מספריים קפיץ 2	מכשירים מדויקים בעולם	מס' 91501-09	טיפ ישר
פלטפורמה סטריאוטקסית	קופף	דגם 900LS
מלקחיים כירורגיים 1	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	קטלוג# 0508-5/45-PO	דגם 5/45, מעוגל
מלקחיים כירורגיים 2	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	catlog# 0103-5-PO	דגם 5, ישר
מלקחיים כירורגיים 3	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	קטלוג# 72912
מלקחיים כירורגיים 4	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	קטלוג# 0508-5/45-PO	דגם 5/45, מעוגל
מנורת ניתוח	לייקה	Leica KL300 LED
דבק רקמות Vetbond	3M טיפול בבעלי חיים	מק"ט:014006

ניתוח