פלואורסצנטיות של נוירונים בהיפוקמפוס חולדה בתוך שבב מיקרופלואידי

תקציר

מקור: Nagendran, T., et al., שימוש בשבבי פלסטיק מיקרופלואידים שהורכבו מראש למידור נוירונים מורינים ראשוניים. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים צביעה אימונופלואורסצנטית של נוירונים בהיפוקמפוס של חולדה שגודלו בתרבית בתוך שבב מיקרופלואידי כדי לנתח התבגרות עצבית וקישוריות.

פרוטוקול

1. פלואורסנציה אימונוסטינציה בתוך השבב

1. הכנת תמיסת קיבוע פורמלדהיד 4% ב-PBS (4% פורמלדהיד, 1 מיקרומטר MgCl₂, 0.1 מיקרומטר CaCl₂, 120 מ"מ סוכרוז)
2. הסר את רוב התקשורת בבארות השבב (לא לייבש תאים פנימיים).
3. מיד להוסיף 100 μL של פתרון קיבוע הבארות העליונות של תאים אקסונליים סומטיים.
4. לאחר דקה אחת, הוסף 100 μL של פתרון קיבוע לבארות התחתונות. תקן במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
5. הסר את רוב הפתרון מבארות השבב (אין לייבש תאים פנימיים). הוסף מיד 150 μL של PBS לכל אחת מהבארות העליונות של התאים האקסונליים והסומאטיים. המתן 2 דקות עד שה- PBS יזרום לבארות התחתונות.
6. חזור על שלב 1.5 פעמיים.
7. הסר את רוב PBS מבארות השבב. הוסף מיד 150 μL של PBS עם 0.25% TritonX-100 לכל אחת מהבארות העליונות של התאים האקסונליים והסומאטיים. המתן 15 דקות.
8. הסר את רוב הנוזל מבארות השבב והוסף מיד 150 מיקרוליטר של תמיסת חסימה (10% סרום עיזים רגיל ב- PBS) לכל אחת מהבארות העליונות של התאים האקסונליים והסומאטיים. המתן 15 דקות.
   הערה: פתרונות חסימה יעילים צריכים להיות ספציפיים לנוגדן המשני, למשל, עבור נוגדן משני נגד חמור נגד כבשים, השתמש בסרום חמור בתמיסת החסימה.
9. הסר את רוב הנוזל מבארות השבב והוסף מיד 100 μL של נוגדנים ראשוניים (או נוגדנים) בסרום עיזים 1% רגיל ב- PBS לכל אחת מהבארות העליונות של התאים האקסונליים והסומאטיים. יש לכסות כדי למזער אידוי ולהמתין שעה אחת בטמפרטורת החדר או 4°C למשך הלילה.
10. הסר את רוב הפתרון מבארות השבב (אין לייבש תאים פנימיים). הוסף מיד 150 μL של PBS לכל אחת מהבארות העליונות של התאים האקסונליים והסומאטיים. המתן 5 דקות עד שה- PBS יזרום לבארות התחתונות.
11. חזור על שלב 1.10 פעמיים.
12. הסר את רוב הנוזל מבארות השבב והוסף מיד 100 מיקרוליטר של נוגדנים משניים (או נוגדנים) ב- PBS לכל אחת מהבארות העליונות של התאים האקסונליים והסומאטיים. מכסים כדי למזער אידוי ולהמתין שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    הערה: עיין בהוראות היצרן לדילול מומלץ של נוגדנים משניים.
13. חזור על שלבים 1.10-1.11.
14. אם ההדמיה מתבצעת תוך יום אחד מבדיקת החיסון, יש לשמור על השבב מלא ב-PBS. אם השבב יאוחסן יותר מיום אחד לפני ההדמיה, עטפו את הצלחת המכילה את השבב בסרט פרפין כדי למנוע אידוי ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4°C עד שהוא מוכן לתמונה.
15. לאחסון ארוך טווח של דגימות, ניתן להשתמש במדיית הרכבה (למשל, Fluoromount-G).
    1. הסר את רוב הנוזל מבארות השבב. השתמש בצינור פלסטיק חד פעמי של 1 מ"ל כדי להוסיף 2 טיפות של אמצעי הרכבה לכל אחת מהבארות העליונות של התאים האקסונליים והסומאטיים.
    2. הטה את השבב כדי לעודד את זרימת המדיה המותקנת דרך הערוצים. לאחר 5 דקות, מוסיפים 2 טיפות לבארות התחתונות. המתן שעה לפני imaging.
       הערה: לאחר שימוש באמצעי הרכבה לא ניתן יהיה לבצע בדיקה מחדש עבור מטרות אחרות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
XonaChip	Xona Microfluidics, LLC	XC150	מחסום מיקרו-חריץ באורך 150 מיקרומטר
XonaChip	Xona Microfluidics, LLC	XC450	מחסום מיקרו-חריץ באורך 450 מיקרומטר
XonaChip	Xona Microfluidics, LLC	XC900	מחסום מיקרו-חריץ באורך 900 מיקרומטר
מעיל מקדים XC	Xona Microfluidics, LLC	XC Pre-Coat	כלול ב-XonaChips
XonaPDL	Xona Microfluidics, LLC	XonaPDL
מדיום נוירובזאלי	תרמופישר סיינטיפיק	21103049
פיפטות פסטר זכוכית	סיגמא-אולדריץ'	CLS7095D5X SIGMA
פירס 16% פורמלדהיד	תרמופישר סיינטיפיק	28906
PBS (פי 10)	תרמופישר סיינטיפיק	QVC0508
סרום עיזים רגיל	תרמופישר סיינטיפיק	16210064
טריטון X-100	תרמופישר סיינטיפיק	28314
נוגדן נגד vGlut1	נוירומאב	75-066	שיבוט N28/9, 1:100
נוגדנים משניים של Alexa Fluor	תרמופישר סיינטיפיק		17:40
מערכת הדמיה קונפוקלית דיסק מסתובב	טכנולוגיית אנדור	CSU-X1, iXon X3 EMCCD	60x שמן סיליקון ו-20x מטרות