כימות של אקטין פונקטה נימה בתאי עצב קליפת המוח של חולדה

תקציר

מקור: Li, H., et al. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta בתאי עצב בקליפת המוח של חולדה. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים את ההליך להכתמה פלואורסצנטית של נוירונים בקליפת המוח של חולדה עבור מיקרוסקופיה. הוא מכוון לחלבונים מסוג F-actin וחלבונים דנדריטיים כדי לנתח שלמות מבנית ולחשב צפיפות F-actin, שהיא חיונית לחקר תפקוד עצבי ובריאות.

פרוטוקול

1. תיוג פלואורסצנטי ואימונוציטוכימיה

הערה: הסימון האימונופלואורסצנטי של תרביות תאים ראשוניות בקליפת המוח בוצע בצלחות תרבית תאים 35 מ"מ עם נפח עבודה של 1 מ"ל.

1. שטפו את צלחת תחתית הזכוכית פעמיים עם מלח חוצץ פוספט pH 7.4 (PBS).
2. תקן תאים עם 4% paraformaldehyde במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
3. יש לשטוף תאים פעמיים עם PBS ולחדור עם 0.1% Triton X-100 ב-PBS למשך 5 דקות.
4. יש לטפל בתאים במשך 20 דקות ב-RT עם כתם F(נימי)-אקטין ספציפי, AlexaFluor 488 Phalloidin (1:40, 25 μl של Phalloidin ב-1 מ"ל PBS).
5. יש לשטוף תאים פעמיים עם PBS ולחסום עם סרום עיזים רגיל 10% ב-RT למשך 1-2 שעות.
6. לדלל את נוגדן anti-MAP2 (חלבון הקשור מיקרוטובול 2) עוף (1:2,500) ב PBS עם 2% סרום עיזים נורמלי לדגור O/N (לילה) ב 4 ⁰C.
7. לאחר הדגירה, יש לשטוף פעמיים ב-PBS.
8. לדלל את הנוגדן המשני (Alexa Red 594-conjugated goat goat anti-chicken IgG (1:500) עם 2% סרום עיזים רגיל ולדגור במשך שעתיים ב RT.
9. יש לשטוף עם PBS ולהוסיף 10 מיקרוליטר/צלחת של צבע Hoescht.
10. יש לדגור במשך 3 דקות ב-RT ולשטוף עם PBS פעמיים.
    הערה: התאים המסומנים מוכנים כעת לשלב 2 (ספירת F-actin puncta).
11. שמור את דגימת התא עם 100 μl של מגיב antifade כסוכן כיסוי ולשמור אותו ב 4 ⁰C בחושך לאחסון לטווח ארוך.
    הערה: פאלואדין יציב יחסית ב- PBS ב +4 ° C בחושך עד שבוע אחד, וניתן לשמר פלואורסצנטיות עם ריאגנטים המחליקים נגד דעיכה. עם זאת, תמונות אופטימליות מתקבלות 1-3 ימים לאחר הצביעה, שכן Phalloidin עשוי להתחיל להתפזר עם אחסון מורחב.

2. F-actin Puncta Counting

1. הפעל את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי ועבור למטרה של 20×. פתח תוכנת מיקרוסקופ והגדר תוכנית בגודל תמונה של 1280×960 פיקסלים ורזולוציית תמונה של 0.17 מיקרומטר/פיקסל בזום של 1×.
2. קבל תמונות של נוירונים F-actin/MAP2 תחת תעלות פלואורסצנטיות ירוקות (495 ננומטר) או אדומות (613 ננומטר).
3. בחר 5 תמונות פלואורסצנטיות ירוקות (F-actin)/אדומות (MAP2) עם תווית חיסונית/כחולה (Hoescht) של נוירונים בודדים עם סוכות דנדריטיות מוגדרות בבירור.
4. זהה את המבנים העשירים באקטין F במקטע הדנדריטי מסדר שני (טווח אורך 25-75 מיקרומטר) עם אימונופלואורסצנטיות MAP2 רציפה.
5. סובבו את האזור שנבחר בתמונות לרמה אופקית. העתק והדבק כתמונה חדשה.
6. הפחיתו את הרקע של תמונות, בעזרת התאמה עקבית לכל מנה.
7. ספרו את ה-F-actin puncta הירוק הבהיר ועקבו אחר אורך המקטע הדנדריטי שנבחר באופן ידני על ידי משקיפים עצמאיים מיומנים. יצא את הנתונים לקובץ גיליון אלקטרוני.
8. חשב את הצפיפות על ידי חלוקת סך F-actin המסומן puncta (N) באורך (L) של הדנדריטים המסומנים MAP2. נתונים מפורשים כמספר F-actin puncta לכל 10 מיקרומטר של דנדריט
   הערה: פונקטה (גודל ≤1.5 מיקרומטר) של פלואורסצנטיות F-אקטין עם עוצמת שיא של לפחות 50% מעל העוצמה הממוצעת של כתמים בפיר הדנדריטי נכללו בכל מקטע דנדריטי שנבחר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
35 מ"מ זכוכית תחתונה כלים מס' 1.5 זכוכית	תאגיד MatTek	P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 בינוני	לייף טכנולוגיות	10565-018
פולי-ל-ליזין	סיגמא	P9155
פרפורמאלדהיד	סיגמא	עמ' 6148
AlexaFluor 488 Phalloidin	לייף טכנולוגיות	A12379
נסיוב סוסים רגיל	לייף טכנולוגיות	26050-070
עוף רב-שבטי אנטי-MAP2	ABCAM	AB92434
Alexa Red 594-conjugated עז נגד עוף IgG	לייף טכנולוגיות	A11042
NucBlue כתם תא חי ReadyProbes מגיב Hoescht 33342	לייף טכנולוגיות	₪1000
חבילת התוכנה NIS-Elements	Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך מבוקר מחשב	Nikon Instruments