$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. בעלי חיים
- השתמשו בחולדות זכרים ונקבות בני 3 חודשים במחקר זה.
- שמרו על בעלי החיים במחזור אור/חושך של 12 שעות עם גישה חופשית למזון ומים.
2. הכנת קוקטייל KAX (קטמין + קסילזין + אצפרומזין) להרדמת בעלי חיים
- ממיסים 50 מ"ג קסילזין (20 מ"ג/מ"ל) בקטמין 5 מ"ל (100 מ"ג/מ"ל) עם 1 מ"ל אצפרומזין (10 מ"ג/מ"ל) ו-3 מ"ל מים מזוקקים. מערבבים היטב.
- יש לעקר עם מסנן מזרק ולאחסן תמיסה זו בבקבוק סרום של 10 מ"ל.
3. הזרקת KAX
- שוקלים בעל חיים (גרם) וחוזרים לכלוב עד שהוא מוכן להזרקה.
- יש להזריק 0.1 מ"ל KAX/100 גרם משקל גוף של בעלי חיים תוך צפקית, באמצעות מזרק אינסולין של 1 מ"ל עם מחט של 28 גרם.
- אפשרו לבעל החיים לאבד את הכרתו. בדוק רפלקסים על ידי צביטת הרגליים והזנב.
- שמור על כל בעלי החיים בבטחה במעבדה למשך הניתוח.
- לאחר הניתוח, החליפו בעלי חיים בכלובים שלהם ושמרו על נוחות בטמפרטורת החדר (RT) עד לחזרה להכרה. יש להחזיר בעלי חיים למתקן בעלי החיים רק כאשר בעלי החיים מתעוררים וחוזרים להתנהגות רגילה.
4. הכנה לניתוח והרכבת מיקרו-מחטים
- הכינו תמיסת NaCl סטרילית של 2 M.
- השתמשו במושך מיקרואלקטרודות (איור 1C) כדי למשוך צינור בורוסיליקט סטנדרטי כבד ומלוטש אחד בקוטר פנימי בקוטר 0.86 מ"מ לתוך שתי מיקרו-מחטי זכוכית מחודדות דק (איור 1D, איור 1E).
- מלאו מיקרו-מחט אחת מהשלב הקודם במי מלח בנפח 2 מ' באמצעות מחט מזרק למילוי אחורי ומזרק בנפח 1 מ"ל (איור 1B). יש להקיש על בועות אוויר מקצה האלקטרודה.
- ממלאים מזרק שני של 1 מ"ל עם 2 M NaCl. חברו מחט של 18 גרם ואז חברו צינור פוליאתילן באורך (כ-10 אינץ') (איור 1A). השתמש בבוכנה מזרק כדי למלא את צינור פוליאתילן עם מלוחים דרך המחט.
- כאשר גם המחט וגם הצינור מלאים במי מלח, חברו בזהירות בין השניים. סלקו כל אוויר בחיבור ביניהם (איור 2).
- שיקוע דק של קצה המחט מיקרו על ידי גירוד אותו קל מאוד על גרגר של מגבת נייר קורס.
- בדוק את התנגדות המחט על ידי לחיצה עדינה על הבוכנה על המזרק עד שניתן לראות זרם עדין של נוזל על מגבת הנייר. זרם הנוזל צריך להיות לא רחב יותר מ 0.5 מ"מ.
5. הכנת בעלי חיים
- יש למרוח 1-2 טיפות הרדמה מקומית על הקרנית (Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP, 0.5%). המתן עד שלא תתרחש רפלקס עיני.
- קוצצים שפם עם מספריים.
- יש להרוות אפליקטור קצה כותנה בתמיסת בטאדין ובאזור המקלון סביב עין הניסוי.
- באמצעות מיקרוסקופ, לחבר hemostat כדי להדק את העפעף התחתון כדי לבלוט את העין, לחשוף את הווריד episcleral ולהגביל את תנועת העין. (איור 3, ראש חץ)
6. הזרקת מי מלח הגורמת לגלאוקומה
- כאשר הרכבת microneedle ואת החיה מוכנים, להתחיל זריקות.
- כאשר אושר שהחיה אינה מגיבה לצביטת רגליים/זנב, נקבו בזהירות את הווריד האפיסקלרלי עם המיקרו-מחט על-ידי הגעה בזווית נמוכה בין 10 ל-20 מעלות לווריד (איור 3, חץ לבן). נקב מוצלח בווריד ניכר כאשר הדם נכנס לקצה המחט (איור 3, חץ שחור).
- לאט ובאופן ידני להזריק כ 50 μl מלוחים לתוך הווריד. פעולה זו אמורה להימשך כ-10 שניות. הוורידים יהיו לבנים כשהמלח זורם דרך כלי הדם (איור 4, ראש חץ). אזורים מסוימים עשויים לשמור על מראה אדום דם (איור 4, חץ).
- בצע זריקה שנייה לתוך הווריד, הפוך לאתר של הראשון, כדי להבטיח נזק רשתית יסודי לשכבת תאי גנגליון הרשתית המלאה.
הערה: בתוך דקות, יש לראות מראה עכור מובהק דרך הקשתית של העין כאשר המלח זורם דרך מערכת כלי הדם.
- יש להשאיר את העין הנגדית ללא טיפול לשימוש כבקרה פנימית.
