בידוד סיבי עמילואיד מתמצית רקמת המוח

תקציר

מקור: Upadhyay, A. et al., טיהור ביוכימי ואפיון פרוטאומי של ליבות סיבי עמילואיד מהמוח. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים את הפרוטוקול לבידוד סיבי עמילואיד מתמצית רקמת מוח של עכבר באמצעות צנטריפוגה של שיפוע צפיפות ועיכול של חלבונים שאינם עמילואידים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. קצירת רקמות וטיהור עמילואיד

הערה: באופן אידיאלי, סיבי עמילואיד צריכים להיות מבודדים מאזורי מוח שזה עתה נותחו. עם זאת, שיטה זו עובדת היטב גם עם רקמות מוח קפואות או הבזק. להלן מתאר קצר של רקמות מוח בהקפאה מהירה לאחסון לשימוש במועד מאוחר יותר.

1. קצירת רקמות מוח ואחסונן: נתחו מוחות של עכברים וקצרו במהירות את האזורים עמוסי העמילואיד (כלומר, קליפת המוח וההיפוקמפוס), ולאחר מכן הקפאה מהירה בחנקן נוזלי או אמבט אלכוהול בקרח יבש.
   הערה: הקפאת הצמד עוזרת לשמר את התכונות המבניות של מרכיבי הרקמה. העכברים מורדמים על ידי איזופלורן ופריקת צוואר הרחם. מומלץ להימנע משימוש ב-CO₂ מכיוון שזה יכול לפגוע בשלמות הפרוטאום במוח.
2. לאחר חיתוך, חיתוך ואחסון רקמות טריות בבלוקים קטנים (למשל, 5 מ"מ על 5 מ"מ), מכיוון שהדבר מאפשר הומוגניזציה יעילה יותר לפני מיצוי עמילואיד. העבירו את הרקמה לבקבוקון הקריוגני הסטרילי, הדקו את המכסה שלו ושקעו במהירות.
3. שמור על רקמות קפואות בתנאים קרים במיוחד (כלומר, -80 מעלות צלזיוס או חנקן נוזלי). אם יש לבצע מיצוי מספר ימים לאחר מכן, אחסן את הרקמות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס והימנע ממחזורי הקפאה והפשרה. הפשירו את הרקמות הקפואות על קרח רטוב כשהן מוכנות למיצוי וטיהור.
   הערה: מגע ישיר של הרקמות עם חנקן נוזלי יכול לגרום לנזק לרקמות ולחלבונים. שימו לב שאמבטיית אלכוהול יכולה להסיר סמנים קבועים מתוויות השפופרת.

2. העשרה של חומר בלתי מסיס נתרן דודציל סולפט (SDS)

הערה: בצע את כל השלבים על קרח וצנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס, אלא אם צוין אחרת. יצרנים ומספרים קטלוגיים של כימיקלים ומכשירים מסופקים בטבלת החומרים.

1. התחל עם אזורי רקמת מוח שזה עתה נותחו או הוקפאו (הופשרו על קרח) המונחים בצינור של 2 מ"ל המכיל 6-8 חרוזי קרמיקה ומאגר הומוגניזציה טרי קר כקרח (1 מ"ל עבור 0.25-1 גרם מסת רקמה רטובה).
2. העבירו את הצינורות להומוגניזטור טחנת החרוזים וטחנו את תכולת הרקמה ב-4000 סל"ד, עם שני מחזורים של 30 שניות כל אחד ומרווח של 30 שניות ביניהם.
   הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במערכות מערבל או הומוגנייזר ממונעות כדי לטחון ולהומוגניזציה של הרקמות.
3. הוסף 9 מ"ל של מאגר הומוגניזציה קר כקרח ל-1 מ"ל של רקמת מוח שלמה הומוגנאט בצינורות של 15 מ"ל, אטום עם רצועות סרט שעווה מעבדה וסובב מקצה לקצה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס כדי להבטיח מסיסות חזקה.
   הערה: כדי להסיר פסולת תאית גדולה ושומנים לא רצויים, למחרת בבוקר, סובבו את הצינורות ב-800 x g ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ואספו את הסופרנטנט בשפופרת טרייה. השעו מחדש את הגלולה שנותרה ב-2 מ"ל של מאגר הומוגניזציה קר כקרח, ערבבו היטב, סובבו שוב במשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ושלבו את שני הסופרנטנטים.
4. מוסיפים לאט לאט סוכרוז מוצק לתרחיף תמצית הרקמה לריכוז סופי של 1.2 M, מערבבים היטב וצנטריפוגה ב-250,000 x g למשך 45 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
5. הסר בזהירות והשליך את הסופרנטנט באמצעות פיפטה. השעו מחדש את הגלולה ב-2 מ"ל של מאגר הומוגניזציה המכיל 1.9 מיליון סוכרוז על ידי טריטוציה, ואחריה צנטריפוגה ב-125,000 x g למשך 45 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
   הערה: ניתן לכוונן את נפח המאגר על סמך כמות החומר ששוחזר מהשלב הקודם. באופן כללי, 10 נפחים של מאגר הומוגניזציה (V/V) הם אידיאליים לשלב זה.
6. אוספים את השכבה המוצקה הלבנה העליונה באמצעות פיפטה, מעבירים אותה לצינור טרי ומסיסים ב-1 מ"ל של מאגר כביסה קר כקרח על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים, מבלי להכניס בועות אוויר.
7. מלבד השכבה העליונה, הגלולה מועשרת גם בסיבי עמילואיד. לקבלת תשואה גבוהה יותר, שלב את שני השברים והמשיך. הסר בזהירות את השכבה המימית האמצעית בעזרת פיפטה והשליך.
8. צנטריפוגה את השברים המשולבים ב-8000 x g למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
9. הוסף 1 מ"ל של מאגר עיכול קר כקרח לגלולה השטופה, השהה מחדש ודגר בטמפרטורת החדר (RT) למשך 3 שעות.
10. צנטריפוגה ב-8000 x g למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והוציאו את הסופרנטנט באמצעות פיפטה.
11. השעו ושטפו (זהה לשלב 2.8) את הכדור המעוכל פעמיים ב-1 מ"ל של מאגר טריס קר כקרח.
12. השעו מחדש את הגלולה השטופה ב-1 מ"ל של מאגר מסיס המכיל 1% SDS ו-1.3 M סוכרוז על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. צנטריפוגה מהירה ב-200,000 x g למשך 60 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: למרות שסיבי העמילואיד עמידים מאוד בפני חומרי ניקוי ודנטורנטים, חשיפה ארוכה מאוד לחומר הניקוי (1% SDS) עלולה להשפיע על שלמות הסיבים או להסיר את החלבונים הקשורים היטב, מה שיפגע בניתוחים הבאים. לכן, מיד לאחר השעיית הכדורים, המשך לצנטריפוגה.
13. שמור את הגלולה והגדל את נפח הסופרנטנט הנותר על ידי הוספת 50 מ"מ מאגר טריס (ביחס של 1:0.3) כדי להפחית את ריכוז הסוכרוז מ-1.3 ל-1 מ' וצנטריפוגה פעם נוספת ב-200,000 x g למשך 45 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
14. ממיסים את שני הכדורים ב-100 מיקרוליטר של מאגר Tris המכיל 0.5% SDS ומאגר לטיהור עמילואיד. כדוריות גלויות הן קטנות ואמורות להיראות אטומות ולבנות (ראו איור 1A).

תוצאות

איור 1: אישור מיצוי עמילואיד באמצעות צביעה ביוכימית והדמיה של סיבי עמילואיד. (A) גלולה בלתי מסיסה SDS המכילה עמילואיד מועשרת נראית בצבע לבן אטום. (B) צביעה אדומה של קונגו של סופרנטנט מסיס SDS וגלולה בלתי מסיסה SDS המכילה עמילואיד מטוהר מוכתם על קרום ניטרוצלולוז 0.45 מיקרומטר; קריאות BCA שימשו לנורמליזציה של כמות הטעינה של החלבונים. בדיקת BCA בוצעה בהתאם להוראות היצר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מעכב פרוטאז	תרמו סיינטיפיק	164535	ניתן להשתמש במכשירים חלופיים, כימיקלים ונוגדנים מיצרנים אחרים
סידן כלורי	סיגמא-אולדריץ'	C1016	ניתן להשתמש במכשירים חלופיים, כימיקלים ונוגדנים מיצרנים אחרים
קולגנאז	סיגמא-אולדריץ'	C0130	ניתן להשתמש במכשירים חלופיים, כימיקלים ונוגדנים מיצרנים אחרים
קוקטייל מעכב פרוטאז שלם	סיגמא-אולדריץ'	11697498001	ניתן להשתמש במכשירים חלופיים, כימיקלים ונוגדנים מיצרנים אחרים
Dnase I	תרמו פישר מדעי	EN0521	ניתן להשתמש במכשירים חלופיים, כימיקלים ונוגדנים מיצרנים אחרים
מנוע מערכת הומוגניזציה של רקמות K54	קול פארמר	Glas-Col 099C	ניתן להשתמש במכשירים חלופיים, כימיקלים ונוגדנים מיצרנים אחרים
אופטימה L-90K אולטרה-צנטריפוגה	בקמן קולטר	BR-8101P-E	ניתן להשתמש במכשירים חלופיים, כימיקלים ונוגדנים מיצרנים אחרים
Precellys 24 הומוגנייזר רקמות	Bertin Instruments	P000062-PEVO0-A	ניתן להשתמש במכשירים חלופיים, כימיקלים ונוגדנים מיצרנים אחרים
נתרן דודציל סולפט (SDS)	סיגמא-אולדריץ'	74255	ניתן להשתמש במכשירים חלופיים, כימיקלים ונוגדנים מיצרנים אחרים
Sorvall Legend Micro 21R מיקרו-צנטריפוגה	תרמו פישר סיינטיפיק	75002446	ניתן להשתמש במכשירים חלופיים, כימיקלים ונוגדנים מיצרנים אחרים
טריס-HCl	תרמו פישר סיינטיפיק	15568025	ניתן להשתמש במכשירים חלופיים, כימיקלים ונוגדנים מיצרנים אחרים