הזרקה תוך-מוחית לניתוח התפלגות ציטומגלווירוס מורין במוח עכבר יילודים

תקציר

מקור: Kawasaki, H., et al. הזרקה תוך-מוחית ותוך-וסקולרית של חלקיקים נגיפיים ומיקרו-כדוריות פלואורסצנטיות למוח היילודים. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים את תהליך ההזרקה התוך-מוחית לחקר התפלגות ציטומגלווירוס מורין (MCMV) במוח עכבר יילודים. MCMV, שתוכנן לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) לנראות, מוזרק לחדר הצידי במוחו של גור עכברים. הנגיף המוזרק מסתובב דרך הנוזל השדרתי, מדביק תאים באזור periventricular, כולל אזור השוליים, מקלעת כורואיד ואזור subventricular.

פרוטוקול

1. הזרקת ICV של מיקרו-כדוריות MCMV ופלורסנט לעכברים יילודים

1. יש לשמור על עכברות ICR הרות תקינות במתקן מבוקר טמפרטורה תחת מחזור אור/חושך של 12 שעות. היילודים מסומנים כ-P 0.5 ביום הלידה.
2. יש לעקר מזרק 10 מיקרוליטר ומחט 27 גרם עם 70% אלכוהול.
3. טען את תמיסת ההזרקה (5 μl) המכילה MCMV או מיקרו-חרוזים פלואורסצנטיים לתוך המחט על ידי משיכה זהירה של הבוכנה של המזרק.
4. לרסן עכבר יילודים (P 0.5) על ידי הנחת העכבר על קרח במשך 3 - 4 דקות. ברגע שבעל החיים נמצא תחת הרדמה, השתמש בשיטת התגובה צביטת הבוהן כדי לקבוע את עומק ההרדמה.
5. סמנו את אתר ההזרקה בעט מעבדה לא רעיל במיקום רוחבי של כ-0.7-1.0 מ"מ לתפר הקשת ו-0.7-1.0 מ"מ קאודלי מהברגמה של היילוד (איור 1A).
6. הכנס את המחט בעומק 2 מ"מ, בניצב למשטח הגולגולת באתר ההזרקה המסומן. לשם השוואה, סמן 2 מ"מ מקצה המחט עם יצרן לא רעיל.
7. הזריקו באיטיות 5 μl של MCMV (בערך 5 × 10,⁵ PFU) לחדר הלטרלי מבלי לפתוח את הקרקפת (איור 1B).
8. בקבוצה אחרת של עכברים, הזריקו תמיסת 5 μl המכילה מיקרו-כדוריות פלואורסצנטיות (0.1 - 0.3 מיקרומטר, בערך 5.75 × 10⁸ חלקיקים) באותה שיטה.
9. הסר באיטיות את המחט 10 - 20 שניות לאחר הפסקת תנועת הבוכנה כדי למנוע זרימה חוזרת.
10. כדי להתאושש, שמרו את העכברים למשך 5 - 10 דקות במיכל חם עד להחזרת התנועה וההיענות הכללית.
11. קצרו את המוח במגוון נקודות זמן (3, 12, 24, 48 ו-72 שעות) לאחר ההזרקה.

תוצאות

איור 1: אתרי הזרקה של עכבר היילוד. (א, ב) הזרקת ICV של 5 μl MCMV (בערך 5 × 10⁵ PFU) או של 5 מיקרו-כדוריות μl (בערך 5.75 × 10⁹ חלקיקים). (A) מקום ההזרקה נמצא בנקודת האמצע בין האוזן לעין (במיקום של כ-0.7 - 1.0 מ"מ רוחבי לתפר הקשת ו-0.7 - 1.0 מ"מ קאודלי מהברגמה של היילוד). (B) מחט 27 גרם עם מזרק 10μl משמשת להזרקה לחדר הצידי בעומק 2 מ"מ, בניצב לפני ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
SPHERO TM פוליסטירן פלואורסצנטי נילוס אדום 0.04-0.06	Spherotech, Inc.	FP-00556-2
SPHERO TM פוליסטירן פלואורסצנטי נילוס אדום 0.1-0.3	Spherotech, Inc.	FP-0256-2
SPHERO TM פוליסטירן פלואורסצנטי נילוס אדום 1.7-2.2	Spherotech, inc.	FP-2056-2
סרום עכבר 10%	דקו	X0910
עכבר C57BL/6	SLC, Inc.
עכבר ICR	SLC, Inc.
מזרקי מיקרוליטר מעובדים (סדרה 7000)	חברת המילטון
מחט 35 מד	סאיטו מדיקל
וקטור pEGFP-N1	קלונטק	#6085-1