מאמר שיטה

הערכת תגובה בין-עצבית לרמזים כימותרפיים מתאי אנדותל פריוונטריקולריים

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Datta, D., et al. מבחני הגירה, משיכה כימותרפית ותרבית משותפת עבור תאי אנדותל אנושיים שמקורם בתאי גזע אנושיים ונוירונים GABAergic. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מציג שיטה לבדיקת נדידת נוירונים בתגובה לרמזים כימותרפיים מתאי אנדותל פריוונטריקולריים (PVEC). תאי עצב פנימיים ממוקמים בתא מרכזי, עם PVEC ותאי בקרה משני הצדדים. הגירה מוגברת לכיוון PVECs מצביעה על תגובה חיובית לאותות הכימותרפיים שלהם.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בדיקת כימו-משיכה

  1. מניחים תרבית תלת בארות במרכז צלחת 35 מ"מ מצופה פולי-L-אורניתין/למינין באמצעות פינצטה סטרילית.
  2. הופכים את המנה. סמן את הגבול סביב התא האמצעי של העלון באמצעות טוש שחור קבוע עם קצה דק במיוחד.
  3. זרע 3 x 104 נוירונים בין-עצביים GABAergic אנושיים בתא האמצעי ב-70 מיקרוליטר של תווך עצבי (איור 1A).
  4. זרעים 104 תאי אנדותל פרי-חדריים אנושיים ב-70 מיקרוליטר של תווך תאי אנדותל פרי-חדריים ו-104 תאי אנדותל בקרה ב-70 מיקרוליטר של תווך תאי אנדותל בקרה בשני התאים החיצוניים, בהתאמה (איור 1A).
  5. הוסיפו 1 מ"ל של מדיום תרבית משותפת (50% מדיום תחזוקה פריוונטריקולרי ללא GABA ו-50% מדיום עצבי) לאורך צד המנה כדי למנוע מהציפוי שעל הצלחת להתייבש.
  6. בדוק תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שתאים אינם דולפים מתא ההחדרה.
  7. לדגור על תאים במשך 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2. לאחר דגירה של 24 שעות, בדקו תחת מיקרוסקופ שהתאים התחברו כראוי ושאין דליפה.
  8. לאחר 48 שעות של זריעה, להסיר בעדינות את העלון באמצעות טוויטר סטרילי. בדוק מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא ששכבת התא אינה מופרעת (יום 0).
  9. הסר את המדיום והוסף 1 מ"ל של מדיום תרבית משותפת טרייה.
    הערה: הקדישו מספר מנות נדרש לתמונות יום 0.
  10. לדגור על תאים במשך 36 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2. לאחר 36 שעות, שאפו בינוני, תקנו תאים עם 4% PFA למשך 10 דקות, ושטפו 3x עם 1x PBS.
  11. להכתים נוירונים פנימיים GABAergic אנושיים עם נוגדן β-טובולין אנטי-אנושי או נוגדן MAP2 אנטי-אנושי. בסוף הליך הצביעה, מוסיפים 1 מ"ל של אמצעי הרכבה נגד דהייה לכל מנה.

2. הדמיה וניתוח נתונים

  1. הניחו את צלחת הבדיקה המוכתמת במערכת החיסון תחת מיקרוסקופ בהגדלה פי 4.
  2. שמור על קצה אחד ארוך של הגבול המלבני (שנעשה בשלב 5.10 לעיל) בשדה הראייה. צלם תמונות של תאים בחלל נטול התאים הסמוך לגבול זה. קבל תמונות לאורך הקצה הארוך הימני והקצה השמאלי הארוך של הגבול המלבני.
    הערה: תאים הממוקמים באלכסון ביחס למלבן אינם נחשבים עקב עמימות בבחירת הקצה הקצר או הארוך כסימן ההתחלה. כמו כן, מספר התאים הנודדים לאורך הקצה הקצר הוא לעתים קרובות קטן משמעותית (אולי בגלל מספר קטן יותר של תאים התחלתיים לאורך הקצה הקצר) ואינם נלקחים בחשבון.
  3. פתח את התמונות ב- ImageJ. חשב את המרחק בין כל תא לבין סימון הגבול באמצעות ImageJ.
  4. כדי להעריך העברה במונחים של מספרי תאים, הגדר מרחק מסוים מהגבול בתמונה שנרכשה ב- ImageJ. ספור את מספר התאים הנמצאים במרחק זה. חישוב מספר ממוצע, סטייה סטנדרטית
  5. ומובהקות סטטיסטית באמצעות תוכנה מתאימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1: בדיקת משיכה של כימו. (A) סכימה של בדיקת המשיכה הכימותרפית. באמצעות תרבית תלת באר, תאי עצב (IN) נזרעו באמצע (מלבן מנוקד ירוק), בעוד תאי אנדותל פריוונטריקולרי (PV ECs; מלבן כתום מנוקד) ותאי אנדותל בקרה (ECs; מלבן מנוקד צהוב) נזרעו משני הצדדים. (B) תמונות של β-טובולין המסומנות בתאי עצב בין-עצביים, המראות נדידה חזקה לעבר תאי אנדותל פרי-חדריים, אך לא לעבר תאי אנדותל ביקורתיים. (C) כימות התגובה הכי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שליטה בתאי אנדותל אנושייםדינמיקה סלולרית₪250
בקרת תאי אנדותל תוסף בינונידינמיקה סלולריתM1019
DMEMF/12 בינוניתרמופישר סיינטיפיק11320033
E6 בינוניתרמופישר סיינטיפיקA1516401
FGF2תרמופישר סיינטיפיקPHG0261
פיברונקטיןתרמופישר סיינטיפיק33016-015
גאבהסיגמא-אולדריץ'A2129
המציטומטרסיגמא-אולדריץ'Z359629
נוירונים GABAergic אנושייםדינמיקה סלולרית₪253
נוירונים GABAergic אנושיים בסיס בינונידינמיקה סלולריתM1010
נוירון GABAergic אנושי תוסף עצבידינמיקה סלולריתM1032
למיניןסיגמאL2020
אמצעי הרכבהמעבדות וקטוריותH-1200
פולי-L-אורניתיןסיגמאעמ' 4957
PBSתרמופישר סיינטיפיק14190
VEGF-Aפפרוטק100-20
ערכת VascuLife VEGF Medium Completeטכנולוגיות תאי חייםLL-0003מרכיב הבקרה של מדיום תאי אנדותל אנושיים
תרבית סיליקון 3 בארות-אינסרט איבידי80369
צלחת 35 מ"מקורנינג430165
פתרון 4% PFAפישר סיינטיפיקAAJ19943K2
מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכהזיסZeiss Axiovert 40C
מיקרוסקופ פלואורסצנטיאולימפוסFSX-100
נוגדן β-טובולין אנטי-אנושיביואגדה802001
נוגדן נגד MAP2נוירומיקהCH22103

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Chemoattraction AssayGABAergicCo CulturePoly L Ornithine

מאמרים קשורים