פלואורסצנטיות immunostaining של פרוסות אורגנואיד cerebellar

תקציר

מקור: Silva, T. P., et al., Scalable Generation of בוגרים Cerebellar Organoids מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ואפיון על ידי Immunostaining. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים את הצביעה האימונופלואורסצנטית של פרוסות אורגנואידים במוח הקטן כדי לזהות אנטיגני מטרה ספציפיים המתבטאים בנוירונים צרבלריים שונים, המעידים על הבשלת אורגנואידים.

פרוטוקול

1. אימונוסטיין של פרוסות אורגנואידים

1. הניחו את שקופיות המיקרוסקופ המכילות קטעי אורגנואיד בצנצנת קופלינג עם 50 מ"ל של PBS 1x שחומם מראש, ומחזיקים עד 10 שקופיות גב אל גב.
   הערה: כל חלקי האורגנואידים צריכים להיות שקועים בנוזל.
2. יש לדגור במשך 45 דקות בטמפרטורה של 37°C כדי לבטל את הג'לטין של המגלשות.
3. שטפו פעם אחת עם 50 מ"ל של 1× PBS במשך 5 דקות ב-RT: העבירו את המגלשות לצנצנת קופלינג המכילה 1× PBS טרי.
4. מעבירים את המגלשות לצנצנת קופלינג המכילה 50 מ"ל גליצין טרי (טבלה 1) ודגרים במשך 10 דקות ב-RT.
5. מעבירים את המגלשות לצנצנת קופלינג המכילה 50 מ"ל של 0.1% טריטון (טבלה 1) ומחלחלים למשך 10 דקות ב-RT.
6. יש לשטוף עם 1× PBS במשך 5 דקות 2x.
7. הכינו את צלחת החיסון עם נייר 3 מ"מ ספוג 1× PBS. יבשו את השקופיות עם טישו מסביב לפרוסות והניחו אותן על נייר 3 מ"מ. בעזרת פיפטה של פסטר, מכסים את כל פני השטח של המגלשות בתמיסת חסימה (טבלה 1), 0.5 מ"ל לכל שקופית. דגירה במשך 30 דקות ב- RT.
8. מוציאים את תמיסת החסימה העודפת ומייבשים את המגלשות עם טישו מסביב לפרוסות. מניחים 50 μL של הנוגדן הראשוני (טבלה 2) מדולל בתמיסת חסימה מעל החלקים ומכסים עם הכיסויים. מניחים את הפרוסות בכלי immunostaining מוכן מראש. לדגור לילה ב 4 °C (75 °F).
9. מעבירים את המגלשות לצנצנת קופלינג עם 50 מ"ל TBST (טבלה 1), נותנים לכיסויים ליפול ושוטפים עם TBST במשך 5 דקות 3x.
10. מניחים 50 μL של הנוגדן המשני מדולל בתמיסת חסימה מעל החלקים ומכסים עם הכיסויים. מניחים את הפרוסות בצלחת immunostaining מוכן מראש. יש לדגור במשך 30 דקות ב-RT, מוגן מאור.
11. מעבירים שוב את המגלשות לצנצנת קופלינג ושוטפים עם 50 מ"ל TBST במשך 5 דקות 3x.
12. יבשו את המגלשות עם טישו מסביב לפרוסות והניחו את הפרוסות בצלחת חיסונית שהוכנה מראש. עם פיפטה פסטר, להוסיף 0.5 מ"ל של פתרון DAPI על כל פני השטח של שקופיות. לדגור במשך 5 דקות ב RT.
13. חזור על שלב 1.9.
14. בזהירות לייבש את המגלשות עם טישו. הוסף 50 μL של הרכבה בינונית טיפה אחר טיפה לאורך המגלשה ולאחר מכן הורד בזהירות כיסוי על כל מגלשה, כופף אותה מעט כדי למנוע בועות.

טבלה 1: פתרונות להכנת אורגנואידים להקפאה וצביעה חיסונית. ברשימה מפורטים כל המרכיבים והנפחים המשמשים להכנת התמיסות המשמשות להכנת אורגנואידים להקפאה ו immunostaining.

ג'לטין/סוכרוז<בר/> ריכוז סופי: 7.5%/15% w/w	1. שוקלים 15 גרם סוכרוז ו-7.5 גרם ג'לטין בבקבוק זכוכית סטרילי של שוט ומערבבים היטב 2. חממו מראש את PBS 1x בטמפרטורה של 65°C 3. מוסיפים PBS שחומם מראש 1x למשקל סופי של 100 גרם ומערבבים היטב 4. מניחים את בקבוק הזכוכית שוט בצלחת חימום בטמפרטורה של 65°C ומנערים עד שהג'לטין נמס 5. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד לתמיסה מתייצבת
גליצין<בר/> ריכוז סופי: 0.1 מטר	הוסף 0.37 גרם גליצין ל 50 מ"ל של PBS טרי מוכן 1x.
פתרון טריטון ריכוז סופי: 0.1% w/v	1. הכינו 10% מלאי Triton X-100: 5 גרם של Triton X-100 ב-50 מ"ל של PBS 1x 2. הוסף 0.5 מ"ל של מלאי Triton X-100 ל- 50 מ"ל של PBS 1x.
TBST 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% עם Tween-20	20 מ"ל Tris 1 M 30 מ"ל NaCl 5 M 5 מ"ל Tween-20 (10 % מלאי: 5 גרם של Tween-20 ב 50 מ"ל מים) ממלאים עד 1 ליטר במים.
פתרון חסימה	הוסף 5 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS, ריכוז סופי: 10% v/v) ל 50 מ"ל של TBST.
פתרון DAPI	הוסף 15 מיקרוליטר של תמיסת ציר DAPI (1 מ"ג/מ"ל) ל-10 מ"ל מים מזוקקים
מוביול	1. הוסיפו 2.4 גרם Mowiol ל-6 גרם גליצרול ונערו במשך שעה בצלחת שחוממה מראש ב-50°C 2. מוסיפים 6 מ"ל מים מזוקקים ומנערים במשך שעתיים< חדרים/> 3. מוסיפים 12 מ"ל של Tris 200 mM (pH 8.5) ומנערים במשך 10 דקות 4. צנטריפוגה בעוצמה של 5,000 × גרם למשך 15 דקות5. Aliquot ולאחסן ב -20 °C.

טבלה 2: נוגדנים ראשוניים. הנוגדנים הראשוניים, השיבוט והדילולים האופטימליים המשמשים להצבת מערכת החיסון מפורטים.

נוגדן	מינים מארחים	דילול
ברהל1	ארנב	1/500
קלבינדין	ארנב	1/500
מפה2	עכבר	1/1000
נ-קדהרין	עכבר	1/1000
נסטין	עכבר	1/400
אוליג2	ארנב	1/500
PAX6	ארנב	1/400
SOX2	עכבר	1/200
TBR1	ארנב	1/200
TBR2	ארנב	1/200
TUJ1	עכבר	1/1000

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נייר 3 מ"מ	WHA3030861	מרק
נוגדן נגד BARHL1	HPA004809	נוגדנים אטלס
נוגדן אנטי-קלבינדין D-28K	CB28	מיליפור
נוגדן Anti-MAP2	M4403	סיגמא
נוגדן אנטי-N-קדהרין	610921	התמרה BD
נוגדן אנטי-נסטין	MAB1259-SP	מו"פ
נוגדן אנטי-OLIG2	צרפת	מיליפור
נוגדן Anti-PAX6	PRB-278P	קובנס
נוגדן אנטי-SOX2	MAB2018	מו"פ
נוגדן נגד TBR1	AB2261	מיליפור
נוגדן נגד TBR2	ab183991	אבקאם
נוגדן Anti-TUJ1	801213	ביואגדה
כיסויים 24x60 מ"מ	631-1575	VWR
דאפי	10236276001	סיגמא
סרום בקר עוברי	A3840001	תרמופישר
ג'לטין מעור בקר	G9391	סיגמא
צנצנת זכוכית קופלינג	E94	תרמופישר
גליצין	MB014001	NZYtech
מונותיוגיצרול	M6154	סיגמא
מוביול	475904	מיליפור	אמצעי הרכבה
טריטון X-100	9002-93-1	סיגמא
טווין-20	עמ' 1379	סיגמא
שקופיות מיקרוסקופ SuperFrost	12372098	תרמופישר	שקופיות מיקרוסקופ הדבקה