$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. יצירת אורגנואידים מוחיים מתרבות דו-ממדית iPSC / hESC (יום 0)
הערה: פרוטוקול זה מניח שתחזוקת תאי גזע (SC) מתבצעת במדיה לתחזוקת תאי גזע נטולי קסנו (SCMM) עם מצע ויטרונקטין או גלטרקס. אם משתמשים באמצעי חלופי לגידול תאי גזע עתירי חלבון, מומלץ להעביר תרביות SC ל-SCMM לפחות שני מעברים לפני תחילת יצירת אורגנואידים. הפרוטוקול לא נבדק בשיטות תרבית SC מבוססות הזנה.
- באמצעות שיטות תחזוקה רגילות של SC, הביאו את התרביות למפגש של 50%-70%. זה בדרך כלל 3-4 ימים לאחר המעבר, אם כי זה יכול להיות תלוי בשיטת התרבית וקו התא.
הערה: יש צורך בכ-2 בארות מצלחת בעלת 6 בארות כדי לייצר צלחת אורגנואידים מלאה בת 96 בארות.
- בדוק תרביות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר בהגדלה של 10X-20X כדי להבטיח מורפולוגיה בריאה של המושבה, ללא הבחנה ניתנת לזיהוי.
- הביאו את SCMM לטמפרטורה של 37°C באמבט מים חמים והפשירו בקבוקון של 50 μL של 50 mM Y-27632 (מעכב סלעים) ו-2 מ"ל של מגיב ניתוק אנזימטי לטמפרטורת החדר.
- הכינו פלטת באר U-bottom 96 בעלת חיבור נמוך במיוחד (ULA), פיפטה P200 רב-ערוצית ומאגר מגיבים בנפח 25 מ"ל.
- Aliquot 45 מ"ל של SCMM בצינור חרוטי 50 מ"ל ולהוסיף 45 μL של 50 mM Y-27632. מערבבים היטב על ידי trituating.
- שאפו ואקום את שתי הבארות המכילות SCs, והוסיפו במהירות 1 מ"ל של מגיב ניתוק נטול אנזימים לכל באר באמצעות פיפטה P1000. דוגרים על הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות.
- שואבים את הבארות המטופלות ומוסיפים 1 מ"ל של מגיב ניתוק אנזימטי לכל באר באמצעות פיפטה P1000.
- דוגרים על הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות נוספות.
- מוציאים את הצלחת ובודקים את הבארות המטופלות. הקש בעדינות על הצלחת כדי לפרק תאים מצטברים. אם אשכולות תאים גדולים עדיין גלויים, דגור על הצלחת למשך 2 דקות נוספות ב- 37 ° C. חזור על שלב זה עד שהאשכולות אינם נראים עוד בעין בלתי.
- לאחר ניתוק התאים כראוי, הוסף 1 מ"ל של SCMM לכל באר כדי להשבית את אנזימי הדיסוציאציה. אסוף את 4 מ"ל של תרחיף התא בצינור חרוטי 50 מ"ל וקח aliquot קטן לספירת תאים.
- החזירו את כל הבארות הנותרות, הלא מטופלות, בצלחת התחזוקה לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
- בזמן הספירה, צנטריפוגו את מתלה התא ב 300 x גרם במשך 5 דקות.
- קבע את מספר התאים הכולל וחשב את כמות התמיסה SCMM + Y-27632 שתידרש להשגת השעיה של 60,000 תאים/מ"ל.
- בזהירות לשאוב לשאוף את supernatant ולהוסיף את נפח מחושב של SCMM + Y-27632 פתרון. מערבבים 5-10 פעמים עם פיפט 5 מ"ל, מה שמבטיח השעיה אחידה של התא.
- העבר מיד את תרחיף התא למאגר מגיב, ופיפטה 150 μL לכל באר של צלחת ULA U-bottom 96-well באמצעות פיפטה P200 רב ערוצית. זה מייצר 96 אורגנואידים בודדים, שכל אחד מהם מורכב בתחילה מ -9,000 תאים.
- צנטריפוגה את הצלחת ב 150 x גרם במשך 1 דקה.
- הכניסו את הצלחת לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C, ואל תפריעו לצלחת במשך 48 שעות.
2. תחזוקת אורגנואיד מוחי (יום 2)
- הכן 17 מ"ל של SCMM עם 17 μL של 50 mM Y-27643 בצינור חרוטי 50 מ"ל. חממו את תמיסת SCMM + Y-27632 ל-37°C באמבט מים חמים.
- קח את צלחת אורגנואיד מן האינקובטור באמצעות פיפטה רב ערוצית P200 להגדיר 75 μL, לצייר לאט מדיום מקצה הבאר בשורה הראשונה. לאחר שהמדיום נמשך, הוציאו במהירות את המדיום חזרה לבאר כדי להרים תאים רופפים ואורגנואידים. חזור על פעולה זו עבור כל שורה.
הערה: טכניקה זו, המכונה להלן "פיזור", מרימה פסולת תאית ואת האורגנואיד לתרחיף. האורגנואיד שוקע במהירות לתחתית הבאר, בעוד שהפסולת הקטנה יותר נשארת בהשעיה, מה שמאפשר להסיר אותה עם שינוי מדיה. זה עוזר למנוע מהאורגנואיד לנוח בפסולת תאית במהלך התרבית.
- לאחר שכל הבארות התפזרו, חכו 15 שניות כדי לוודא שהאורגנואידים שקעו לתחתית כל באר.
- לשאוף לאט ובזהירות 75 מיקרוליטר של תווך מכל באר באמצעות פיפטה P200 רב ערוצית ולחלק לתוך מאגר פסולת.
הערה: רוב המשתמשים שואפים מדי פעם אורגנואיד במהלך הזנות רגילות. זה יכול להתרחש בערך 1% מהזמן. אנא תכננו בהתאם כדי להבטיח שמספיק אורגנואידים ישרדו לנקודות זמן ניסיוניות.
- העבר תמיסת SCMM + Y-27632 למאגר מגיבים ושחרר 150 μL לכל באר אורגנואיד באמצעות פיפטה P200 הרב-ערוצית.
- מחזירים את הצלחת לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C.
3. תחזוקת אורגנואיד מוחי (יום 3)
- חם 17 מ"ל של SCMM ל 37 ° C, הפעם ללא Y-27643.
- כאשר פיפטת P200 הרב-ערוצית מוגדרת ל-100 מיקרוליטר, פזרו את כל הבארות של צלחת האורגנואיד (ראו שלב 2.2). המתינו 15 שניות כדי לוודא שהאורגנואידים שקעו לתחתית הבארות שלהם.
- הכינו מאגר פסולת והעבירו SCMM מחומם למאגר מקור.
- בזהירות לשאוף 125 μL של בינוני מכל באר ולהחליף עם 150 μL של SCMM טרי באמצעות פיפטה P200 רב ערוצית.
- מחזירים את הצלחת לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C.
4. תחזוקת אורגנואיד מוחי (יום 4+)
הערה: יש לבצע תחזוקה שוטפת זו אחת ליומיים עד להדבקה.
- לפני תחילת ההזנה ביום 4, להכין תווך אינדוקציה עצבית (NI).
- הפשיר 250 μL aliquot של 2 מ"ג / מ"ל הפרין, יחד עם בקבוקון אחד 5 מ"ל של 100X N-2 מוסף. הוסף את 250 μL של הפרין, 5 מ"ל של 100X N-2, ו- 5 מ"ל של 100X חומצות אמינו חיוניות בינוניות-לא חיוניות (MEM-NEAA) ל- 500 מ"ל של תערובת הנשר הבינוני/מזין F-12 (DMEM/F12) + GlutaMAX של Dulbecco. מסנן סטרילי את התמיסה המעורבת במסנן 500 מ"ל.
הערה: יש לשמור על NI בטמפרטורה של 4°C כאשר אינו בשימוש; NI נמשך עד שבועיים לפני בינוני טרי צריך להיות מוכן.
- חם 17 מ"ל של NI בינוני עד 37 ° C.
- כאשר פיפטת P200 הרב-ערוצית מוגדרת ל-100 מיקרוליטר, פזרו את כל הבארות של צלחת האורגנואיד (ראו שלב 2.2). המתינו 15 שניות כדי לוודא שהאורגנואידים שקעו לתחתית הבארות שלהם.
- הכינו מאגר פסולת והעבירו NI מחומם למאגר מקור.
- בזהירות לשאוף 125 μL של בינוני מכל באר ולהחליף עם 125 μL של NI טרי באמצעות פיפטה P200 רב ערוצית.
- מחזירים את הצלחת לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C.
5. זיהום אורגנואיד בנגיף זיקה (ZIKV) (~ יום 24)
הערה: לאחר כ -3 שבועות של התמיינות יהיו מבנים נוירואפיתליאליים גדולים ורוזטות גלויות בתוך האורגנואיד שיהיו רגישים מאוד לזיהום ZIKV.
- הביאו את תמיסת המלח המאוזנת 1X של ארל (EBSS), 1X מלח חוצץ פוספט (PBS) ו-NI ל-37°C באמבט מים חמים.
- לדלל ZIKV של ריכוז ידוע ב- 1X EBSS למכפיל זיהום היעד של זיהום (MOI).
הערה: טיטרציות של MOI שונות מומלצות כדי להשיג תגובה למינון נגיפי. זה עשוי להשתנות בהתאם לזן הנגיף; עבור ATCC VR-1838 ו- ATCC VR-1843, ערכי MOI טיפוסיים נעים בין 0.1 ל- 10).
- הסר בזהירות את כל המדיום מבאר אורגנואיד באמצעות פיפטה P200 ערוץ יחיד. הוסף במהירות 200 μL של 1X PBS לכל באר באמצעות פיפטה רב ערוצית P200 כדי לשטוף את האורגנואידים.
- הסר בזהירות את כל המדיום מבאר אורגנואיד באמצעות פיפטה P200 ערוץ יחיד. הוסף במהירות 50 μL של 1X EBSS בלבד (זיהום מדומה) או תמיסת וירוס ZIKV היטב וודא שהאורגנואיד שקוע לחלוטין. חזור על הפעולה עבור כל אורגנואיד שאמור להיות נגוע עבור המחקר.
- החזירו את הצלחת לאינקובטור של 37°C למשך שעתיים
הערה: דגירה על אורגנואידים נגועים בדמה למשך זמן זה לא אמורה להשפיע באופן משמעותי על גדילתם בהשוואה לאורגנואידים ללא הפרעה.
- כ -30 דקות לפני השלמת הדגירה הנגיפית, aliquot 25 מ"ל של NI לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ולהביא ל 37 ° C באמבט מים חמים.
- לאחר השלמת החשיפה הנגיפית, שטפו את האורגנואידים עם 200 μL של 1X PBS לכל באר, אפשרו לאורגנואידים להסתפק ב-15 שניות, ולאחר מכן הסירו 1X PBS באמצעות פיפטה P200 בערוץ יחיד.
- מוסיפים 200 מיקרוליטר NI טרי לכל באר, ומחזירים לאינקובטור.
- אופציונלי: במשך נקודת זמן של יום 0, ניתן לצלם אורגנואידים שעה לאחר ההדבקה.
- המשך לתרבית על ידי החלפת 125 μL NI כל יומיים בשיטת הפיזור (ראה שלב 4). הקפד להיפטר כראוי מדיה בילה טיפים, כמו זה מכיל חלקיקי זיהומיות ZIKV.