הערכת הכדאיות העצבית בתרבית נוירונים במוח הקטן באמצעות צביעה כפולה

תקציר

מקור: Jiajia, L., et al. הערכת הכדאיות העצבית באמצעות פלואורסצאין דיאצטט-פרופידיום יודיד צביעה כפולה בתרבית נוירון גרגיר המוח הקטן. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים את השיטה לזיהוי תאי עצב מתרבית מעורבת של תאי עצב גרגיריים צרבלריים ותאי גלייה באמצעות צביעה כפולה עם דיאצטט פלואורסצאין (FDA) ופרופידיום יודיד (PI), כאשר נוירונים חיים מופיעים ירוקים ונוירונים מתים מופיעים באדום.

פרוטוקול

1. צביעה כפולה של FDA-PI ובתרבית נוירון גרגיר המוח הקטן (CGN)

1. הכן תמיסת עבודה פלואורסצאין דיאצטט-פרופידיום יודיד (FDA-PI) על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של תמיסת מלאי FDA (ריכוז סופי: 10 מיקרוגרם / מ"ל) ו -50 מיקרוליטר של תמיסת מלאי PI (ריכוז סופי: 50 מיקרוגרם / מ"ל) ב -10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS). מערבבים על ידי מערבולות ומניחים על קרח.
   הערה: הכן מחדש את פתרון העבודה של פתרון העבודה FDA-PI ממש לפני השימוש.
2. הוציאו את צלחת תרבית התאים מהאינקובטור. שים אותו על קרח.
3. שאפו את מדיום התרבות והחליפו אותו ב-PBS קר.
   הערה: שינוי הפתרון חייב להיעשות לאט ובזהירות. הימנע לגעת בתאים עם קצות פיפטה.
4. שאפו את ה-PBS הקר והחליפו אותו ב-FDA-PI קר (500 מיקרוליטר/באר עבור צלחות תרבית תאים של 12 בארות או 1 מ"ל/באר עבור צלחות תרבית תאים של 6 בארות). השאירו על קרח למשך 5 דקות.
5. לשאוף את ה- FDA-PI ולהוסיף PBS קר (100 μL / well עבור צלחות תרבית תאים 12 באר או 50 μL / באר עבור צלחות תרבית תאים 6 באר).
   הערה: אין לאפשר לתאים להתייבש בעת צילום תמונות.
6. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמש במסנן עירור עם פס מעבר של 450 - 490 ננומטר. זהה את פליטות הפלואורסצנטיות עבור ה- FDA וה- PI ב- 520 ו- 620 ננומטר, בהתאמה. באותם תנאים, צלם תמונה תחת אור רגיל באמצעות מצב ניגודיות הפאזה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
   הערה: צלם תמונות תוך 15 דקות לאחר FDA-PI. זמן החשיפה הוא 100-300 מילישניות, והרווח האנלוגי הוא פי 2.8.

2. הערכת הכדאיות העצבית

1. עבור צביעה כפולה של FDA-PI, שכב את התמונות של התאים שזוהו לאחר סינון על ידי מסנני פלואורסצנטיות שונים על ידי גרירת השכבה החיובית ל- FDA על שכבת PI-positive בתוכנת עורך גרפי.
   1. התאם את האטימות של השכבה החיובית ל- FDA על ידי הזנת "50%" בשדה "אטימות" בחלונית "שכבות". מיזוג שתי שכבות על ידי לחיצה על כפתור "מיזוג גלוי" בתפריט "שכבה". הגדר את הניגודיות של תמונות שכבת-העל על-ידי הזנת "50" בשדה "ניגודיות" תחת "תמונה"| "התאמות" | "בהירות/ניגודיות." ודא שאין תאים חיוביים כפולים של FDA ו- PI בתמונות שכבת העל.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סרום בקר עוברי	גיבקו	10099141	FBS באיכות גבוהה חיונית לתרבות
100× גלוטמין	גיבקו	25030081
100× אנטי ביוטי	גיבקו	15240062
מדיום BME	גיבקו	21010046
דיאצט פלואורסצאין	סיגמא	F7378
פרופידיום יודיד	סיגמא	עמ' 4170
נוגדן ארנב נגד GAP43	אבקאם	ab75810
עכבר נוגדן Anti-GFAP	איתות סלולרי	3670
פיפטה פסטר	וולאק	Z310727	יש לצרוב את החוד לפני השימוש
צלחות תרבית תאים 6 בארות	TPP	Z707759	צלחת תרבית תאים באיכות גבוהה חיונית לתרבית
מסנן	מיליפור	SLGP033RB
פיפט 5 מ"ל	אקסל ביו	CS017-0003
פיפט 10 מ"ל	אקסל ביו	CS017-0004
אינקובטור CO2	תרמו סיינטיפיק	311
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	ניקון	TI-S
מסנן פלואורסצנטי וקוביות אמיסיון	ניקון	B-2A, G-2A, UV-2A
תוכנת צילום	ניקון	שקל-אלמנטס
עורך גרפי softeware	אדובי	פוטושופ CS
תוכנה לעיבוד תמונה	NIH	ImageJ