הדמיה של תאי עצב בגוף פטריות במוחות דרוזופילה באמצעות צביעת מערכת החיסון

תקציר

מקור: Kelly, S. M., et al. דיסקציה וצביעה אימונופלואורסצנטית של תאי עצב של גוף פטרייה וקולטני אור במוחות בוגרים של דרוזופילה מלנוגסטר. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים פרוטוקול חיסוני מפורט כדי להמחיש פגמים פנוטיפיים בגופי הפטריות של מוחות דרוזופילה מוטנטיים. הפרוטוקול כולל שימוש בנוגדנים נגד Fas2, חלבון המעורב בהנחיה אקסונלית המאפשרת התפתחות מורפולוגית ותפקודית תקינה של גוף הפטרייה.

פרוטוקול

1. הליך קיבוע וצביעה אימונופלואורסצנטית

1. באמצעות פיפטה p200, מעבירים מוחות מנותחים מצלחת 9 בארות לצינור מיקרוצנטריפוגה 0.5 מ"ל מלא 0.5 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד מדולל ב-PTN (0.1 M נתרן פוספט חוצץ pH 7.2, 0.1% פעילי שטח לא יוניים). לפחות 10 - 15 מוחות של אותו גנוטיפ יכולים להיות משולבים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה אחד. כל השלבים הנותרים (עד הרכבת המוח על שקופיות) הושלמו בצינורות מיקרוצנטריפוגות 0.5 מ"ל.
   זהירות: Paraformaldehyde (PFA) צריך להיות מטופל במכסה אדים. יש לשמור את פסולת PFA ולסלק אותה כראוי. עשרים אחוז מהפארפורמלדהיד הנרכש באמפולות זכוכית ניתן לחבר לצינורות מיקרוצנטריפוגות ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לצורך.
2. בתוך מכסה מנוע, יש לדגור על המוח ב-4% פרפורמלדהיד למשך 20 דקות עם נדנוד איטי בטמפרטורת החדר.
3. לאחר הקיבוע, אפשרו למוחות להתיישב לתחתית צינור המיקרוצנטריפוגה באמצעות כוח הכבידה.
   הערה: המוח עשוי להידבק מדי פעם לצד של צינור המיקרוצנטריפוגה. אם זה קורה, זה בדרך כלל מועיל לסובב לרוחב את הצינור בין האצבע המורה לאגודל או להקיש בעדינות על הצינור על הספסל כדי לקדם את שקיעת המוח.
4. הסר את הקיבוע באמצעות פיפטה p1000 ובצע שתי שטיפות "מהירות" עם 500 μL של PTN, המאפשר למוח להתיישב לתחתית צינור מיקרוצנטריפוגה בין שטיפות. במהלך השטיפות המהירות האלה, ברגע שכל המוחות התיישבו על ידי כוח הכבידה לתחתית צינור המיקרוצנטריפוגה, ניתן להחליף מיד את ה-PTN בחיץ טרי; אין צורך בזמן כביסה נוסף.
   הערה: בדרך כלל, השארת חיץ נוסף בצינור עדיפה על סיכון הסרת המוח. בדיקה זהירה של קצה פיפטה נדרשת לעתים קרובות כדי לוודא שאף מוח לא הוצא בטעות מהצינור. אם מוחות הוחדרו בטעות לקצה, שחררו אותם בחזרה לצינור המיקרוצנטריפוגה, המתינו עד שהמוחות יירגעו, ואז המשיכו לסלק את כל שאריות ה-PTN.
5. לאחר השטיפה המהירה האחרונה, השתמשו בפיפט p1000 כדי לבצע שלוש שטיפות "ארוכות": הוסיפו 500 מיקרוליטר PTN וכבסו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר על נדנדה/אגוז. כל השטיפות "הארוכות" העתידיות צריכות להיות למשך 20 דקות.
   הערה: ניתן לאחסן מוחות קבועים למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C ב-PTN לאחר שטיפות אלה.
6. יש להסיר את השטיפה האחרונה באמצעות פיפטה p1000 ולדגור על המוח על נדנדה או נוטטור בטמפרטורת החדר בתמיסה חוסמת של 0.5 מ"ל [PTN + 5% סרום עיזים רגיל (NGS)] למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר.
   1. נוגדנים משניים של עיזים ישמשו בשלבי הפרוטוקול הבאים. אם משתמשים בנוגדנים משניים ממין אחר, יש להשתמש בסרום רגיל מאותו מין (ולא ב- NGS) בתמיסות החסימה והנוגדנים.
7. באמצעות פיפטה p1000, להסיר את הפתרון חוסם ולהוסיף את הנוגדן העיקרי מדולל PTN (PTN + 5% NGS + נוגדן ראשוני מדולל). כאשר משתמשים בנוגדן ראשוני בפעם הראשונה, יש לקבוע את הדילול האופטימלי של אותו נוגדן באופן אמפירי.
   הערה: כדי להמחיש נוירונים בגוף פטריות, נוגדנים המזהים Fas2 משמשים בדרך כלל. נוגדנים אלה זמינים מבנק Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) כנוגדן 1D4 ויש לדלל אותם ביחס של 1:20 ב-PTN + 5% NGS.
8. לדגור על המוח בתמיסת נוגדנים ראשונית על נדנדה/נוטטור במשך 2-3 לילות ב-4 מעלות צלזיוס.
9. לאחר הדגירה עם נוגדנים ראשוניים, לאפשר למוח להתיישב לתחתית צינור המיקרוצנטריפוגה ולאחר מכן להסיר את תמיסת הנוגדנים הראשונית.
10. באמצעות פיפטה p1000, בצע 2 שטיפות "מהירות" ו -3 שטיפות "ארוכות" של 20 דקות עם 0.5 מ"ל של PTN כמתואר לעיל בשלבים 1.4 ו -1.5, בזהירות לאפשר למוח להתיישב על ידי כוח הכבידה לתחתית צינור מיקרוצנטריפוגה בין כל שטיפה.
11. לדגור על המוח במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר עם נוגדנים משניים מתאימים המסומנים פלואורסצנטית. נוגדנים משניים מדוללים בדרך כלל ב 0.5 מ"ל של PTN + 5% NGS בריכוז של 1:200.
    הערה: לאחר הוספת נוגדנים משניים פלואורסצנטיים, המוח צריך להישמר בחושך למשך שארית הניסוי.
12. לאחר דגירה שניונית של נוגדנים, אפשרו למוח להתיישב בתחתית צינור המיקרוצנטריפוגה ולהסיר את תמיסת הנוגדנים המשנית.
13. בצעו 2 שטיפות "מהירות" ו-3 שטיפות "ארוכות" של 20 דקות עם 0.5 מ"ל של PTN כמתואר לעיל בשלבים 1.4 ו-1.5, תוך מתן אפשרות למוח להתיישב בזהירות לתחתית צינור המיקרוצנטריפוגה בין כל שטיפה.
14. לאחר השטיפה השלישית "הארוכה" של 20 דקות, השתמשו בפיפט p200 כדי להסיר כמה שיותר חיץ.
15. הוסף 75 μL של מדיום הרכבה פלואורסצנטי נגד דהייה למוח. מוח פיפטה והרכבה של מדיום לתוך קצה פיפטה פעם אחת כדי לערבב. אין להפוך את הצינור מכיוון שהמוח עלול להיתקע על הפקק או הצדדים של צינור המיקרוצנטריפוגה.
    הערה: לאחר השעיית המוח בתווך הרכבה, ניתן לעטוף את הצינורות ברדיד אלומיניום כדי להאט את המרווה הפלואורופורית ולאחסן אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. במידת הצורך, ניתן לאחסן את המוח במשך מספר ימים בטמפרטורה של 4°C, אך באופן אידיאלי יש להרכיבו על מגלשות בהקדם האפשרי.

2. הרכבת מוח בוגר D. melanogaster על מיקרוסקופ שקופיות והדמיה

1. בנה שקופית "גשר". הניחו שני כיסויי "בסיס" במרחק של כ-1 ס"מ זה מזה על מגלשה טעונה חיובית. ודא שהצד הטעון חיובית של המגלשה פונה כלפי מעלה. הדביקו את הכיסויים לשקופית עם לק, כפי שמוצג באיור 1A. איטום שלושת הקצוות החיצוניים של כל כיסוי בסיס עם לק לציפורניים מועיל בדרך כלל כדי להבטיח שאמצעי ההרכבה לא יתפתלו מתחת לכיסויי בסיס אלה. יש לתת ללק להתייבש לחלוטין (10 - 15 דקות) לפני שתמשיך.
2. הניחו את המגלשה מתחת לסטריאומיקרוסקופ ופיפטה את תמיסת המדיה המכילה את המוחות המנותחים לתוך החלל שבין שתי הכיסויים. כדי לספק ניגודיות רבה יותר, כדאי לתמרן את פנסי צוואר האווז כך שיהיו מקבילים לראש הספסל.
3. הסר מדיה הרכבה נוספת מן השקופית באמצעות פיפטה, נזהר לא pipette את המוח מן השקופית.
4. פתל מדיית הרכבה נוספת. זה יאפשר למוח להיות ממוקם בצורה מדויקת יותר במהלך השלב הבא.
5. באמצעות זוג מלקחיים והסטריאומיקרוסקופ, מקמו את המוחות על המגלשה בתבנית רשת עם אונות אנטנה הפונות כלפי מעלה.
6. הניחו פתק כיסוי ("הגשר") מעל המוחות (איור 1A). השתמשו בלק לציפורניים כדי לאטום את צידי החלקת כיסוי הגשר במקום שבו הם באים במגע עם החלקות כיסוי "הבסיס".
7. באמצעות פיפטה p200, מלאו באיטיות את החלל המרכזי שמתחת לגשר באמצעי הרכבה טריים (איור 1B). הניחו טיפה אחת בכל פעם על הקצה הפתוח של המכסה המרכזי ואפשרו למדיית ההרכבה להתפתל מתחת למכסה הגשר המרכזי. המשיכו עד שכל החלל מתמלא באמצעי הרכבה, ואז אטמו את החלק העליון והתחתון בלק שקוף.
8. לאחר שהלק יבש, דמיינו את השקופיות מיד או אחסנו בקופסת שקופיות הדוקה חסינת אור בטמפרטורה של -20°C.
9. בתוך שבוע, המוח מצלם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר עם לייזר עירור וקוביות סינון המתאימות לנוגדנים המשניים הפלואורסצנטיים שנבחרו. תמונות Z-stack של נוירונים בגוף פטריות מתקבלות בדרך כלל באמצעות מטרות של 20X או 40X.

תוצאות

איור 1. הרכבת מוחות כהכנה להדמיית אימונופלואורסצנטיות. (A) מוחות מורכבים על מגלשות SuperFrost Plus עם כיסוי גשר כדי למנוע שיטוח מוח. שני כיסויי "בסיס" מודבקים למגלשה טעונה חיובית SuperFrost Plus עם לק שקוף ומוחות חתוכים מונחים ביניהם. פתק כיסוי "גשר" שקוף ממוקם מעל המוח ומודבק לכיסויי הבסיס. (B) לאחר שהלק התייבש, Vectashield נמרח באיטיות מתחת לגשר כדי לשמר את הפלואורסצנטיות של הנוגדן המשני. לאחר מכן ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מיקרודיסקציה מלקחיים/פינצטה	טד פלה	505 ניוטון מטר
מנות סילגארד	מכשור מערכות חיות	DD-50-S-BLK	זמין מ- amazon.com
נוגדן Fas2	מחקרים התפתחותיים בנק היברידיומה	1D4
נוגדן Chaoptin	מחקרים התפתחותיים בנק היברידיומה	24ב10
נוגדן GFP	מעבדת Aves	GFP-1010
Alexa488 עז נגד עכבר נוגדן משני	תרמופישר	A-11001
Alexa488 עז נגד עוף נוגדן משני	תרמופישר	A-11039
Alexa647 נוגדן משני נגד עכבר	תרמופישר	A-21236
20% פרפורמאלדהיד	שירותי מיקרוסקופ אלקטרונים	RT15713
VectaShield	מעבדות וקטוריות	H-1000
מגלשות SuperFrost Plus	תרמופישר	99-910-01
כיסויים	תרמופישר	12-553-454
Na Phosphate Buffer monobasic	סיגמא	S3139
Na פוספט Buffer dibasic	סיגמא	S3264
טריטון X 100	סיגמא	X100-100 מ״ל
לק לציפורניים	שירותי מיקרוסקופ אלקטרונים (EMS)	72180
סטריאומיקרוסקופ	Leica S6D עם מקור אור LED KL300
צלחת 9 בארות (צלחת ספוט)	VWR	89090-482
נוטטור/נדנדה	פישר	22-363-152 או 88-861-041
צלחת 35 מ"מ	ג'נסי סיינטיפיק	32-103
סילגארד	פישר	50-366-794
קימווייפ	פישר	06-666
מאגרי קיבוע פוטנציאליים
מאגר PTN			0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, בדרך כלל מהווים 0.5 ליטר של חיץ NaPhosphate 0.1M ואליציטוט 50ml בכל פעם לפי הצורך
Fly Stocks זמין מבלומינגטון
אל"ב (C155)-GAL4		BL458	מנהל התקן GAL4 פאן-עצבי
w*;;; OK107-GAL4		BL 854	דרייבר GAL4 לכל נוירוני גוף הפטריות (החדרת OK107-GAL4 היא בכרומוזום 4)
י(1), ו(67ג23); ג739-גל4		BL 7362	דרייבר GAL4 לאונות אלפא ובטא (בכרומוזום שני)
y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS- CD8-GFP		BL 64305	מנהל התקן GAL4 לאונות אלפא ובטא, מכיל גם UAS-CD8- GFP
w*; 201Y-GAL4		BL 4440	דרייבר GAL4 בעיקר לאונות הגמא של גוף הפטרייה (בכרומוזום השני)
י(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS- CD8-GFP		BL 64296	דרייבר GAL4 לאונות גמא בגוף פטריות, מכיל גם UAS- CD8-GFP