גרימת דלקת עצבית בזחלי דגי זברה עם הזרקת ליפופוליסכריד

תקציר

מקור: He, Y. et al. מיקרו-הזרקות חדריות במוח של ליפופוליסכריד לדגי זברה זחלים להערכת דלקת עצבית ורעילות עצבית. J. Vis. Exp. (2022).

הסרטון מדגים מיקרו-הזרקה של ליפופוליסכרידים (LPS) למוחם של זחלי דגי זברה כדי לגרום לדלקת עצבית. הזחלים ממוקמים על צלחת מרופדת באגרוז, המחט מוחדרת לחדרי המוח, וה-LPS מוזרק. ה-LPS המוזרק מעורר תגובה חיסונית שמובילה לדלקת עצבית.

פרוטוקול

1. הכנה למיקרו-הזרקה

1. התכוננו להזרקה על ידי משיכת נימי זכוכית באמצעות מושך מיקרופיפטה (ראו טבלת חומרים), בהתאם לפרוטוקול בן חמישה שלבים למשיכת צינור נימי זכוכית (טבלה 1).
2. פתח את קצה המחט (נימי זכוכית דקים [3.5 אינץ'] עם חוט להט, קוטר חיצוני [OD] 1.14 מ"מ) לגודל המתאים בזווית באמצעות מלקחיים (איור 1A).
3. מלא את המחט עם 0.1 מ"ל של שמן מינרלי כדי להבטיח כי אין בועות.
4. הסר את מכסה הבורג של מחט הפלדה של מנגנון המיקרו-הזרקה. יישרו את חור מחט הזכוכית עם מחט הפלדה ולאחר מכן הדקו את מכסה הבורג. הרכיבו את מכשיר המיקרו-הזרקה של המחט הטעונה במיקרומניפולטור (ראו טבלת חומרים).
5. התאם את המיקום של מנגנון המיקרו-הזרקה, כך שהמיקרומניפולטור יוכל להזיז את המכשיר בצורה גמישה מתחת למיקרוסקופ. פריקה נפח מסוים של שמן פרפין כדי להפוך את מחט הפלדה להיכנס צינור זכוכית נימי.
6. זרוק את תמיסת ההזרקה (כגון 1× מלח חוצץ פוספט (PBS) או 5 מ"ג / מ"ל LPS) על מגלשת זכוכית מעוקרת עם 70% אתנול ולהתאים את מנגנון המיקרו-הזרקה כך שהקצה יוכנס לטיפת הנוזל. טען ~ 2 μL של תמיסת הזרקה לתוך המחט.
7. הגדירו את המיקרומניפולטור (הגדרות כוונון עדינות של למעלה, למטה, שמאלה וימינה) כך שקצה המחט של מכשיר המיקרו-הזרקה יהיה באותו שדה ראייה כמו הזחלים בהגדלה גבוהה (איור 1B).

2. הרכבה של דגי זברה למיקרו-הזרקות

הערה: התפתחות המוח של דג הזברה מתרחשת תוך 3 ימים לאחר ההפריה (dpf) ומבשילה בגיל 5 dpf עם מערכת עצבים מרכזית מפותחת. לכן, 5 זחלי dpf כבר מתאימים לחקר נזק עצבי בתיווך LPS, כמו גם תגובות התנהגותיות ודלקתיות.

1. הזריקו את זחלי דגי הזברה תוך כ-30 דקות מרגע הגעתם לשלב העניין, כדי לשמור על עקביות תזמון ההזרקה.
2. כדי להרדים את זחלי דגי הזברה, ערבבו טריקאין עם מי מיכל דגים נקיים (ריכוז סופי של 0.02% w/v tricaine).
3. יש להמיס תמיסה של 2% אגרוז במים מזוקקים פעמיים (ddH₂O) באמצעות מיקרוגל. יוצקים את האגרוז המותך לצלחת פלסטיק. ניתן לאחסן את צלחת הפלסטיק המצופה באגרוז 2% בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
4. השתמשו בפיפטת העברה מפלסטיק כדי להעביר זחלים מורדמים למרכז צלחת הפלסטיק המצופה באגרוז 2%. כיוון הזחלים הרכובים עם צד המוח כלפי מעלה לגישה למחט.

3. הזרקת חדר המוח

1. התאימו את ההגדלה של המיקרוסקופ כך שמבנה חדר המוח של דגי זברה יוצג בבירור בשדה הראייה (איור 1B).
2. הניחו את המחט בזהירות מעל טקטום המוח (איור 1C).
3. נקב את העור של המוח של דג הזברה עם קצה המחט לאט באמצעות micromanipulator.
4. לחץ על דוושת הרגל כדי להוציא 1 nL של 1x PBS או ריכוזים שונים של LPS (1.0, 2.5 ו- 5.0 מ"ג/מ"ל) (ראה טבלת חומרים). תמונות מוצלחות של הזרקת חדר שבו חדר המוח הוזרק עם 1 nL של 1% צבע כחול אוונס (מדולל ב-PBS) מוצגות כדוגמה (איור 1D). מעבירים את הזחלים למי ביצה נקיים (E3) מיד לאחר ההזרקה. לאחר 24 שעות, לאסוף את הזחלים עבור הדמיה מיקרוסקופית, בדיקת התנהגות קטר, וקביעת אינדיקטורים אחרים.

תוצאות

טבלה 1: פרוטוקול בן חמישה שלבים למשיכת צינור נימי זכוכית.

צעד	זמן פעולה (שניות)	רמת חום	פעולה
T1	L>	H80-89	P1L005
T2	1.6-3	H00
T3<...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגרוז	סיגמא-אולדריץ'	A6361
אגרוז, טמפרטורת ג'לינג נמוכה	סיגמא-אולדריץ'	A9414
Drummond Nanoject III מזרק ננוליטר ניתן לתכנות	דרמונד סיינטיפיק	3-000-207
מיקרוסקופים סטריאופוניים פלואורסצנטיים	לייקה	M205 FA
Lipopolysaccharides מ Escherichia coli O111:B4	סיגמא-אולדריץ'	L3024
מיקרומניפולטור ידני	מכשירים מדויקים בעולם	M3301
שמן מינרלי	סיגמא-אולדריץ'	M5904
מלח חוצץ פוספט	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 4417
נימי זכוכית דקים לקיר (4 אינץ') עם חוט להט, OD 1.5 מ"מ	מכשירים מדויקים בעולם	TW150F-4
טריקאין (3-אמינו חומצה בנזואית אתיל אסטר)	סיגמא-אולדריץ'	A-5040