מידול מוות עצבי של חמצן תגובתי בתאי עצב של גרגרי המוח הקטן בעכבר

תקציר

מקור: Laaper, M. et al., מידול מוות עצבי וניוון בנוירונים גרגיריים צרבלריים ראשוניים של עכברים.J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מתאר את היצירה של מודל פגיעה עצבית באמצעות מיני חמצן תגובתי (ROS) בנוירונים גרגיריים צרבלריים ראשוניים של עכברים. הוא מפרט את התהליך של גרימת עקה חמצונית על ידי הוספת ריכוזים גבוהים של מי חמצן. חשיפה ל-ROS גורמת לשברים בגדילי הדנ"א ולחוסר יציבות גנומית. בנוסף, חמצון חלבונים תאיים פוגע בתפקודם, בעוד חמצון שומנים פוגע בשלמות הממברנה. מפל זה מוביל לשחרור ציטוכרום c והפעלת קספז, וכתוצאה מכך אפופטוזיס עצבי.

פרוטוקול

1. הכנה ניסויית

הערה: ניתן להכין ולתחזק את פתרונות המלאי הבאים עד לשימוש.

1. פתרון דיסקציה
   1. ממיס 3.62 גרם נתרן כלורי (NaCl), 0.2 גרם אשלגן כלורי (KCl), 0.069 גרם נתרן פוספט (NaH₂PO₄ ∙ H₂O), ו-1.306 גרם D-(+)-גלוקוז ב-500 מ"ל H₂O מזוקק. לאחר מכן, הוסף 12.5 מ"ל של חיץ HEPES, 450 μL של תמיסת פנול אדומה, ו 20 מ"ל של אלבומין בסרום בקר (BSA) חלק V לתמיסה. כוונן ל- pH 7.4 באמצעות 1 N נתרן הידרוקסידי (NaOH).
   2. יש לעקר עם מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב-4°C. פתרון זה יישאר יציב עד שבוע עד 10 ימים.
2. טריפסין
   1. הכינו תמיסת ציר בריכוז של 25 גרם/ליטר טריפסין ב-0.9% נתרן כלורי. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של -20°C.
3. מעכב טריפסין
   1. הכינו ציר עם ריכוז של 10 מ"ג/מ"ל על ידי המסת 1 גרם של מעכב טריפסין לבן ביצה של תרנגולת ב-100 מ"ל של 1 מ"מ הידרוכלוריד. אחסנו תמיסה זו בטמפרטורה של -20°C.
4. דאוקסיריבונוקלאז (DNase)
   1. יש להמיס 100 מ"ג DNase 1 ב-10 מ"ל מים סטריליים ליצירת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של -20°C.
5. מגסו₄
   1. הוסף 6.02 גרם של מגנזיום גופרתי (MgSO₄) ל 50 מ"ל של מים מזוקקים (H₂O) כדי ליצור מלאי 1 M. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4°C.
6. CaCl₂
   1. ממיסים 0.735 גרם סידן כלורי (CaCl₂∙ 2H₂O) ב-50 מ"ל H₂O מזוקק לריכוז מלאי של 100 mM. יש לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4°C.
7. KCl
   1. יש להמיס 3.7275 גרם KCl ב-50 מ"ל H₂O מזוקק לריכוז מלאי של 1 M. יש לאחסן תמיסה ב-4°C.
8. D-(+)-גלוקוז
   1. להמיס 1.802 גרם של D-(+)-גלוקוז ב 50 מ"ל של H₂O מזוקק לריכוז מלאי של 100 mM. יש לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4°C.
9. מדיה לתרביות תאים
   1. הכינו את מדיית תרבית התאים באופן הבא: 5 מ"ל של סרום בקר עוברי מחויג מומת בחום, 500 מיקרוליטר של 200 מ"מ L-גלוטמין, 100 מיקרוליטר של 50 מ"ג/מ"ל גנטמיצין ו-1 מ"ל של 1.0 מ"ל KCL 1.0 מ"ל של 45 מ"ל של מדיה חיונית מינימלית (E-MEM) מעוקרת במסנן של Eagle, בתוספת 1.125 גרם/ליטר D-גלוקוז כדי לייצר 50 מ"ל של מדיה תרבית של נוירון גרגיר המוח הקטן (CGN). יש לאחסן מדיה בטמפרטורה של 4°C.
10. ציטוזין בטא-D- ארבינו פורנוסיד
    1. להמיס 48 מ"ג של ציטוזין בטא-D-arabino furanoside ב 10 מ"ל של מצע גידול לריכוז מלאי של 20 mM. יש לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של -20°C.
11. פולי-די-ליזין
    1. כדי ליצור מלאי פולי D-ליזין של 2 מ"ג/מ"ל, יש להוסיף 10 מ"ל של H₂O סטרילי ל-20 מ"ג פולי-ליזין. מלאי פולי D-ליזין צריך להיות מאוחסן ב -80 °C ב 100 μL aliquots.
       הערה: יש להכין את התמיסות הבאות לפני הנתיחה ולשמור על טמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
12. תמיסת דיסקציה משלימה_{MgSO 4}
    1. הוסף 300 μL של מלאי MgSO₄ עד 250 מ"ל של תמיסת דיסקציה.
13. פתרון דיסקציה טריפסין
    1. הוסף 100 μL של טריפסין מלאי ו 12 μL של מלאי MgSO₄ עד 10 מ"ל של תמיסת דיסקציה.
14. פתרון מעכב טריפסין 1
    1. הוסף 164 μL של מעכב טריפסין מלאי, 250 μL של מלאי DNase 1 ו 12 μL של מלאי MgSO₄ עד 10 מ"ל של תמיסת דיסקציה.
15. פתרון מעכב טריפסין 2
    1. הוסף 1040 μL של מעכב טריפסין מלאי, 750 μL של מלאי DNase 1 ו 12 μL של מלאי MgSO₄ עד 10 מ"ל של תמיסת דיסקציה.
16. תמיסת דיסקציה משלימה CaCl₂
    1. הוסף 10 μL של מלאי CaCl₂ ו 25 μL של מלאי MgSO₄ עד 10 מ"ל של תמיסת דיסקציה.
17. כלי תרבות מצופים פולי די-ליזין
    1. כדי לצפות מנות תרבית, לדלל 100 μL של מלאי פולי D-ליזין ב 40 מ"ל של סטרילי H₂O. לקבלת כלי תרבית Nunc 35 מ"מ, הוסף 2 מ"ל של תמיסת פולי D-ליזין מדוללת. עבור 4 צלחות באר, להוסיף 300 μL של פולי מדולל D-ליזין לכל באר.
    2. תן פולי D-ליזין לשבת 1 שעה לפני שאיפה ושטיפה כל באר עם 4 מ"ל או 600 μL (עבור 35 מ"מ צלחת תרבית או 4 צלחות באר, בהתאמה) של סטרילי H₂O. לאחר מכן שאפו את H₂O ותנו לכלים להתייבש במשך שעה אחת.

2. מיצוי המוח ובידוד המוח הקטן

1. ערפו את ראשו של גור עכבר בן 6-7 ימים באמצעות מספריים לעריפת ראש. בצע את הדיסקציה של המוח בתרבית רקמה סטרילית.
2. כדי להסיר את המוח, אחזו בראש באמצעות זוג מלקחיים וחתכו דרך העור לכיוון החלק הקדמי של הראש באמצעות מספריים מיקרודיסקציה כפי שמודגם באיור 1. לאחר מכן חותכים דרך עצם הגולגולת באמצעות זוג מספריים חדש כדי למזער את הסיכון לזיהום. הסר את הגולגולת המכסה את המוח באמצעות מלקחיים והקניט את המוח באמצעות מלקחיים או מרית.
   1. לפי הצורך, לחתוך דרך עצב הראייה כדי להקל על הוצאת המוח בכללותו.
3. מקם את המוח בתמיסת דיסקציה, אשר בתוספת MgSO₄. שמור את הפתרון ואת המוח על קרח.
4. לאחר הסרת המוח, תחת מיקרוסקופ דיסקציה, נתחו את המוח הקטן מהמוח בעודו עדיין בתמיסת דיסקציה משלימה MgSO₄, והסירו את קרומי המוח באמצעות מלקחיים עדינים. סובבו את המוח הקטן לצד הגחוני שלו והבטיחו הסרה של מקלעת הכורואידים.
5. ארזו את הסרבלה לתוך צלחת 35 מ"מ המכילה ~ 1 מ"ל של תמיסת דיסקציה מוסיפה MgSO₄.
6. קוצצים את הרקמה לחתיכות קטנות ומעבירים לצינור 50 מ"ל המכיל 30 מ"ל של תמיסת דיסקציה חוצצת MgSO₄.

3. עכבר גרגיר המוח הקטן בידוד וטיפוח של תאי עצב

1. צנטריפוגה צינור 50 מ"ל המכיל את רקמת המוח קצוץ במשך 5 דקות ב 644 x גרם ו 4 ° C.
2. הסר את supernatant ולהוסיף 10 מ"ל של תמיסת טריפסין דיסקציה. לאחר מכן, נער את הצינור במהירות גבוהה במשך 15 דקות ב 37 ° C.
3. הוסף 10 מ"ל של תמיסת מעכב טריפסין 1 לצינור והתנדנד בעדינות במשך 2 דקות.
4. צנטריפוגה את הצינור במשך 5 דקות ב 644 x גרם ו 4 ° C.
5. הסר את supernatant ולהוסיף 2 מ"ל של תמיסת מעכב טריפסין 2, ולאחר מכן להעביר צינור 15 מ"ל.
6. Triturate את הרקמה בצינור 15 מ"ל עד התמיסה הופך עכור. ואז תן להסתפק 5 דקות.
7. מוציאים את הסופרנאטנט השקוף ומעבירים את הסופרנאטנט לצינור חדש המכיל 1 מ"ל של תמיסת דיסקציה מוסיפה CaCl₂.
8. הוסף עוד mL של תמיסת מעכב טריפסין 2 לתחתית הצינור המכיל את הגלולה משלב 3.6. משלשלים שוב ומניחים להסתפק ב-5 דקות. הסר את הסופרנאטנט והוסף אותו לצינור המכיל את הסופרנאטנט משלב 3.7 (כלומר חזרה על שלבים 3.6-3.7). חזור על תהליך זה עד שרוב הרקמה מנותקת מכנית.
9. הוסף 0.3 מ"ל של תמיסת דיסקציה מוסיפה CaCl₂ לאוסף supernatant עבור כל מ"ל של supernatant.
10. מערבבים את תכולת הצינור ולאחר מכן צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 644 x גרם.
11. מוציאים את הסופרנאטנט ומוסיפים 10 מ"ל של מדיה טרייה לגלולה ומערבבים.
12. לאחר מכן ניתן לספור ולדלל תאים לריכוז של 1.5 x 10⁶ תאים / מ"ל. שימו לב שבאופן כללי צפויים 10 מיליון תאים מכל מוח מנותח, תלוי בזמן הטריפסיניזציה וביעילות הדיסקציה. תאי צלחת על לוחות פולי D-ליזין שנעשו בעבר. עבור צלחות 4 באר, צלחת 0.5 מ"ל, נותן 7.5 x 10⁵ תאים לכל באר. עבור כלים 35 מ"מ, צלחת 4 מ"ל, נותן 6 x 10⁶ תאים לכל צלחת.
13. לאחר 24 שעות, הוסף ציטוזין-β-arabino furanoside (AraC) לצלחות כדי להפחית זיהום גלייה. עבור כל מ"ל של מדיה 0.5 μL של 20 mM AraC נדרש. הוספת AraC אינה דורשת שינוי תקשורתי. אם יש לשמור על התאים במשך 7-8 ימים, חזור על טיפול זה ביום השלישי.
14. לשמור על תרביות באינקובטור 5% CO₂ ב 37 ° C ולהאכיל עם 100 μL של גלוקוז 100 mM הוסיף לתרבית עבור כל 2 מ"ל של מדיה כל יומיים האחרונים 5 ימים. אין צורך בשינוי מדיה מלא.

4. מידול פגיעה עצבית

1. כדי לגרום למוות תאי הנגרם על ידי ROS (עקה חמצונית), יש לטפל בתאי עצב במי חמצן של 75-100 מיקרומטר (H₂O₂) ולעבור למדיה מותנית מתרביות מקבילות לאחר חשיפה של 5 דקות ל-H₂O₂. שימו לב, עקב חוסר היציבות של H₂O₂, מטבו את הריכוז לרמה שגורמת למוות תאי של 50-70% בתרבית לאחר 24 שעות של טיפול (איור 2).

תוצאות

איור 1: הסרת מוח עכבר ודיסקציה של המוח הקטן. (A) כדי לחלץ את מוחו של עכבר בן 6-7 ימים, באמצעות זוג מלקחיים, אחזו בראש וחתכו את העור קדימה לאורך הקווים המקווקוים באמצעות זוג מספריים מיקרודיסקציה. היזהרו לחתוך רק את העור ואת רקמת החיבור, חתך עמוק מדי עלול לנקב את הגולגולת ולפגוע במוח. שלושת החתכים הללו, ישרים לאורך קו האמצע, ושניים מתעקלים לרוחב, מאפשרים לדחוף את העור לאחור ולחשוף את ה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכת טיטרציה לנטיבטרל qPCR	א.ב.מ	#LV900
פתרון טיהור וירוסים מהיר	א.ב.מ	#LV999
pCMV-dR8.2	אדג'ין	#8455
pCMV-VS.VG	אדג'ין	#8454
מים מזוקקים	גיבקו	#15230162
200 מ"ל ל-גלוטמין	גיבקו	#25030081
35 מ"מ כלי תרבות Nunc	גיבקו	#174913
תערובת מאסטר ירוקה PowerUP SYBR	טכנולוגיות חיים	#A25742
פתרון BSA V	סיגמא אולדריץ'	#A-8412
CaCl2 • 2H2O	סיגמא אולדריץ'	#C-7902
קמפטוטצין	סיגמא אולדריץ'	#C-9911
מעכב טריפסין חלבון ביצת תרנגולת	סיגמא אולדריץ'	#10109878001
ציטוזין בטא-D-ארבינו פורנוסיד	סיגמא אולדריץ'	#C-1768
D-(+)-גלוקוז	סיגמא אולדריץ'	#G-7528
צרפת	סיגמא אולדריץ'	#11284932001
נשר - מדיום חיוני מינימלי	סיגמא אולדריץ'	#M-2279
גליצין	סיגמא אולדריץ'	#G-5417
חום מומת חייג עובר סרום בקר עוברי	סיגמא אולדריץ'	#F-0392
חיץ Hepes	סיגמא אולדריץ'	#H-0887
מי חמצן	סיגמא אולדריץ'	#216763
50 מ"ג/מ"ל גנטמיצין	סיגמא אולדריץ'	#G-1397
MgSO4	סיגמא אולדריץ'	#M-2643
N-מתיל-D-חומצה אספרטית	סיגמא אולדריץ'	#M-3262
תמיסה אדומה פנול	סיגמא אולדריץ'	#P-0290
טריפסין	סיגמא אולדריץ'	#T-4549
ליפופקטמין 3000	תרמו פישר סיינטיפיק	L3000-008
מגיב משפר P3000	תרמו פישר סיינטיפיק	L3000-008
Opti-MEM I סרום מופחת בינוני	תרמו פישר סיינטיפיק	31985070
KCl	VWR	#CABDH9258
NaCl	VWR	#CABDH9286
NaH2PO4H2O	VWR	#CABDH9298
פולי די-ליזין	VWR	#89134-858
DMEM	וויסנט	#319-005-CL
פ.ב.ס.	וויסנט	#080-450