מידול מוות עצבי של חמצן תגובתי בתאי עצב של גרגרי המוח הקטן בעכבר

1. הכנה ניסויית

הערה: ניתן להכין ולתחזק את פתרונות המלאי הבאים עד לשימוש.

1. פתרון דיסקציה
   1. ממיס 3.62 גרם נתרן כלורי (NaCl), 0.2 גרם אשלגן כלורי (KCl), 0.069 גרם נתרן פוספט (NaH₂PO₄ ∙ H₂O), ו-1.306 גרם D-(+)-גלוקוז ב-500 מ"ל H₂O מזוקק. לאחר מכן, הוסף 12.5 מ"ל של חיץ HEPES, 450 μL של תמיסת פנול אדומה, ו 20 מ"ל של אלבומין בסרום בקר (BSA) חלק V לתמיסה. כוונן ל- pH 7.4 באמצעות 1 N נתרן הידרוקסידי (NaOH).
   2. יש לעקר עם מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב-4°C. פתרון זה יישאר יציב עד שבוע עד 10 ימים.
2. טריפסין
   1. הכינו תמיסת ציר בריכוז של 25 גרם/ליטר טריפסין ב-0.9% נתרן כלורי. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של -20°C.
3. מעכב טריפסין
   1. הכינו ציר עם ריכוז של 10 מ"ג/מ"ל על ידי המסת 1 גרם של מעכב טריפסין לבן ביצה של תרנגולת ב-100 מ"ל של 1 מ"מ הידרוכלוריד. אחסנו תמיסה זו בטמפרטורה של -20°C.
4. דאוקסיריבונוקלאז (DNase)
   1. יש להמיס 100 מ"ג DNase 1 ב-10 מ"ל מים סטריליים ליצירת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של -20°C.
5. מגסו₄
   1. הוסף 6.02 גרם של מגנזיום גופרתי (MgSO₄) ל 50 מ"ל של מים מזוקקים (H₂O) כדי ליצור מלאי 1 M. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4°C.
6. CaCl₂
   1. ממיסים 0.735 גרם סידן כלורי (CaCl₂∙ 2H₂O) ב-50 מ"ל H₂O מזוקק לריכוז מלאי של 100 mM. יש לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4°C.
7. KCl
   1. יש להמיס 3.7275 גרם KCl ב-50 מ"ל H₂O מזוקק לריכוז מלאי של 1 M. יש לאחסן תמיסה ב-4°C.
8. D-(+)-גלוקוז
   1. להמיס 1.802 גרם של D-(+)-גלוקוז ב 50 מ"ל של H₂O מזוקק לריכוז מלאי של 100 mM. יש לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4°C.
9. מדיה לתרביות תאים
   1. הכינו את מדיית תרבית התאים באופן הבא: 5 מ"ל של סרום בקר עוברי מחויג מומת בחום, 500 מיקרוליטר של 200 מ"מ L-גלוטמין, 100 מיקרוליטר של 50 מ"ג/מ"ל גנטמיצין ו-1 מ"ל של 1.0 מ"ל KCL 1.0 מ"ל של 45 מ"ל של מדיה חיונית מינימלית (E-MEM) מעוקרת במסנן של Eagle, בתוספת 1.125 גרם/ליטר D-גלוקוז כדי לייצר 50 מ"ל של מדיה תרבית של נוירון גרגיר המוח הקטן (CGN). יש לאחסן מדיה בטמפרטורה של 4°C.
10. ציטוזין בטא-D- ארבינו פורנוסיד
    1. להמיס 48 מ"ג של ציטוזין בטא-D-arabino furanoside ב 10 מ"ל של מצע גידול לריכוז מלאי של 20 mM. יש לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של -20°C.
11. פולי-די-ליזין
    1. כדי ליצור מלאי פולי D-ליזין של 2 מ"ג/מ"ל, יש להוסיף 10 מ"ל של H₂O סטרילי ל-20 מ"ג פולי-ליזין. מלאי פולי D-ליזין צריך להיות מאוחסן ב -80 °C ב 100 μL aliquots.
       הערה: יש להכין את התמיסות הבאות לפני הנתיחה ולשמור על טמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
12. תמיסת דיסקציה משלימה_{MgSO 4}
    1. הוסף 300 μL של מלאי MgSO₄ עד 250 מ"ל של תמיסת דיסקציה.
13. פתרון דיסקציה טריפסין
    1. הוסף 100 μL של טריפסין מלאי ו 12 μL של מלאי MgSO₄ עד 10 מ"ל של תמיסת דיסקציה.
14. פתרון מעכב טריפסין 1
    1. הוסף 164 μL של מעכב טריפסין מלאי, 250 μL של מלאי DNase 1 ו 12 μL של מלאי MgSO₄ עד 10 מ"ל של תמיסת דיסקציה.
15. פתרון מעכב טריפסין 2
    1. הוסף 1040 μL של מעכב טריפסין מלאי, 750 μL של מלאי DNase 1 ו 12 μL של מלאי MgSO₄ עד 10 מ"ל של תמיסת דיסקציה.
16. תמיסת דיסקציה משלימה CaCl₂
    1. הוסף 10 μL של מלאי CaCl₂ ו 25 μL של מלאי MgSO₄ עד 10 מ"ל של תמיסת דיסקציה.
17. כלי תרבות מצופים פולי די-ליזין
    1. כדי לצפות מנות תרבית, לדלל 100 μL של מלאי פולי D-ליזין ב 40 מ"ל של סטרילי H₂O. לקבלת כלי תרבית Nunc 35 מ"מ, הוסף 2 מ"ל של תמיסת פולי D-ליזין מדוללת. עבור 4 צלחות באר, להוסיף 300 μL של פולי מדולל D-ליזין לכל באר.
    2. תן פולי D-ליזין לשבת 1 שעה לפני שאיפה ושטיפה כל באר עם 4 מ"ל או 600 μL (עבור 35 מ"מ צלחת תרבית או 4 צלחות באר, בהתאמה) של סטרילי H₂O. לאחר מכן שאפו את H₂O ותנו לכלים להתייבש במשך שעה אחת.

2. מיצוי המוח ובידוד המוח הקטן

1. ערפו את ראשו של גור עכבר בן 6-7 ימים באמצעות מספריים לעריפת ראש. בצע את הדיסקציה של המוח בתרבית רקמה סטרילית.
2. כדי להסיר את המוח, אחזו בראש באמצעות זוג מלקחיים וחתכו דרך העור לכיוון החלק הקדמי של הראש באמצעות מספריים מיקרודיסקציה כפי שמודגם באיור 1. לאחר מכן חותכים דרך עצם הגולגולת באמצעות זוג מספריים חדש כדי למזער את הסיכון לזיהום. הסר את הגולגולת המכסה את המוח באמצעות מלקחיים והקניט את המוח באמצעות מלקחיים או מרית.
   1. לפי הצורך, לחתוך דרך עצב הראייה כדי להקל על הוצאת המוח בכללותו.
3. מקם את המוח בתמיסת דיסקציה, אשר בתוספת MgSO₄. שמור את הפתרון ואת המוח על קרח.
4. לאחר הסרת המוח, תחת מיקרוסקופ דיסקציה, נתחו את המוח הקטן מהמוח בעודו עדיין בתמיסת דיסקציה משלימה MgSO₄, והסירו את קרומי המוח באמצעות מלקחיים עדינים. סובבו את המוח הקטן לצד הגחוני שלו והבטיחו הסרה של מקלעת הכורואידים.
5. ארזו את הסרבלה לתוך צלחת 35 מ"מ המכילה ~ 1 מ"ל של תמיסת דיסקציה מוסיפה MgSO₄.
6. קוצצים את הרקמה לחתיכות קטנות ומעבירים לצינור 50 מ"ל המכיל 30 מ"ל של תמיסת דיסקציה חוצצת MgSO₄.

3. עכבר גרגיר המוח הקטן בידוד וטיפוח של תאי עצב

1. צנטריפוגה צינור 50 מ"ל המכיל את רקמת המוח קצוץ במשך 5 דקות ב 644 x גרם ו 4 ° C.
2. הסר את supernatant ולהוסיף 10 מ"ל של תמיסת טריפסין דיסקציה. לאחר מכן, נער את הצינור במהירות גבוהה במשך 15 דקות ב 37 ° C.
3. הוסף 10 מ"ל של תמיסת מעכב טריפסין 1 לצינור והתנדנד בעדינות במשך 2 דקות.
4. צנטריפוגה את הצינור במשך 5 דקות ב 644 x גרם ו 4 ° C.
5. הסר את supernatant ולהוסיף 2 מ"ל של תמיסת מעכב טריפסין 2, ולאחר מכן להעביר צינור 15 מ"ל.
6. Triturate את הרקמה בצינור 15 מ"ל עד התמיסה הופך עכור. ואז תן להסתפק 5 דקות.
7. מוציאים את הסופרנאטנט השקוף ומעבירים את הסופרנאטנט לצינור חדש המכיל 1 מ"ל של תמיסת דיסקציה מוסיפה CaCl₂.
8. הוסף עוד mL של תמיסת מעכב טריפסין 2 לתחתית הצינור המכיל את הגלולה משלב 3.6. משלשלים שוב ומניחים להסתפק ב-5 דקות. הסר את הסופרנאטנט והוסף אותו לצינור המכיל את הסופרנאטנט משלב 3.7 (כלומר חזרה על שלבים 3.6-3.7). חזור על תהליך זה עד שרוב הרקמה מנותקת מכנית.
9. הוסף 0.3 מ"ל של תמיסת דיסקציה מוסיפה CaCl₂ לאוסף supernatant עבור כל מ"ל של supernatant.
10. מערבבים את תכולת הצינור ולאחר מכן צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 644 x גרם.
11. מוציאים את הסופרנאטנט ומוסיפים 10 מ"ל של מדיה טרייה לגלולה ומערבבים.
12. לאחר מכן ניתן לספור ולדלל תאים לריכוז של 1.5 x 10⁶ תאים / מ"ל. שימו לב שבאופן כללי צפויים 10 מיליון תאים מכל מוח מנותח, תלוי בזמן הטריפסיניזציה וביעילות הדיסקציה. תאי צלחת על לוחות פולי D-ליזין שנעשו בעבר. עבור צלחות 4 באר, צלחת 0.5 מ"ל, נותן 7.5 x 10⁵ תאים לכל באר. עבור כלים 35 מ"מ, צלחת 4 מ"ל, נותן 6 x 10⁶ תאים לכל צלחת.
13. לאחר 24 שעות, הוסף ציטוזין-β-arabino furanoside (AraC) לצלחות כדי להפחית זיהום גלייה. עבור כל מ"ל של מדיה 0.5 μL של 20 mM AraC נדרש. הוספת AraC אינה דורשת שינוי תקשורתי. אם יש לשמור על התאים במשך 7-8 ימים, חזור על טיפול זה ביום השלישי.
14. לשמור על תרביות באינקובטור 5% CO₂ ב 37 ° C ולהאכיל עם 100 μL של גלוקוז 100 mM הוסיף לתרבית עבור כל 2 מ"ל של מדיה כל יומיים האחרונים 5 ימים. אין צורך בשינוי מדיה מלא.

4. מידול פגיעה עצבית

1. כדי לגרום למוות תאי הנגרם על ידי ROS (עקה חמצונית), יש לטפל בתאי עצב במי חמצן של 75-100 מיקרומטר (H₂O₂) ולעבור למדיה מותנית מתרביות מקבילות לאחר חשיפה של 5 דקות ל-H₂O₂. שימו לב, עקב חוסר היציבות של H₂O₂, מטבו את הריכוז לרמה שגורמת למוות תאי של 50-70% בתרבית לאחר 24 שעות של טיפול (איור 2).

איור 1: הסרת מוח עכבר ודיסקציה של המוח הקטן. (A) כדי לחלץ את מוחו של עכבר בן 6-7 ימים, באמצעות זוג מלקחיים, אחזו בראש וחתכו את העור קדימה לאורך הקווים המקווקוים באמצעות זוג מספריים מיקרודיסקציה. היזהרו לחתוך רק את העור ואת רקמת החיבור, חתך עמוק מדי עלול לנקב את הגולגולת ולפגוע במוח. שלושת החתכים הללו, ישרים לאורך קו האמצע, ושניים מתעקלים לרוחב, מאפשרים לדחוף את העור לאחור ולחשוף את הגולגולת. לאחר החשיפה, ניתן לחדור לגולגולת עם קצה המספריים, ולחתוך קדמית. יש להקפיד מאוד שלא לפגוע במוח הקטן כדי להקל על זיהוי והסרת קרומי המוח. לאחר החיתוך, ניתן להשתמש במלקחיים כדי לקלף בחזרה את הגולגולת, ולחשוף את המוח אשר לאחר מכן ניתן להקניט אותו לתמיסת דיסקציה קרירה באמצעות זוג מלקחיים או מרית. על מנת להסיר את המוח, ייתכן שיהיה צורך לקטוע את עצב הראייה. (B) לאחר שהוסרו מהגולגולת, יש להסיר את קרומי המוח הקטן מהמוח הקטן באמצעות זוג מלקחיים בעלי קצוות עדינים. (C) באמצעות זוג מלקחיים עדינים, המוח הקטן מנותח מהרקמה הנותרת ונבדק כדי להבטיח הסרה מלאה של קרומי המוח.

איור 2: מידול פגיעה עצבית בתאי עצב בגרגירים צרבלריים. צרבלה מבודדת מעכברי יום 6-7 מנותקת לתאים בודדים בעקבות ההליך המוצג בחלק 3. לאחר הדיסוציאציה, תאים נספרים ומושהים מחדש בנפח של מדיה תרבית כדי ליצור 1.5 x 106 תאים / מ"ל.עבור צלחות 35 מ"מ, 4 מ"ל מצופים, נותן 6 x 106 תאים לכל צלחת. עבור שקופיות הדמיה, 0.5 מ"ל הוא מצופה, נותן 7.5 x 105 תאים / באר. לאחר מכן CGNs יכולים להיות מומרים עם lentivirus או נגועים באדנווירוס. שימוש באדנווירוס ביום הציפוי (0 ימים במבחנה (DIV)) נותן יעילות טרנספקציה של יותר מ -90% ומאפשר מחקר של פגיעה עצבית באמצעות מתח חמצוני ונזק ל- DNA. תוספת של 10 מיקרומטר קמפטוטצין (CPT) תגרום נזק לדנ"א, בעוד 75-100 מיקרומטר מי חמצן (H2O2) יגרום לעקה חמצונית. הריכוז של H2O2 חייב להיות אופטימלי כדי לגרום למוות של 50% תאים לאחר 24 שעות. הדבקה באדנווירוסים ב 5 DIV נותנת יעילות התמרה נמוכה יותר של פחות מ -10%. ב-7 DIV כאשר קולטני NMDA מועשרים בתרבית, ניתן לטפל בתאי עצב עם 100 מיקרומטר NMDA ו-10 מיקרומטר גליצין כדי לגרום לאקסיטוטוקסיות. זה אידיאלי עבור ניתוח הדמיה לאחר מכן או מעקב אחר נוירון יחיד. לבסוף, התמרות עם lentivirus ב 0 DIV, ואחריו טיפול עם 100 μM NMDA ו 10 מיקרומטר גליצין ב 7 DIV, נותן יעילות התמרה גבוהה מספיק (>80%) כדי לאפשר ניתוח ביוכימי של התרבית, כולל ריצוף ChIP, בחינת ביטוי חלבונים, וביצוע בדיקות חיות/מתות.