$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.
1. אימונוהיסטוכימיה
- צביעה אנלוגית של תימידין
- מניחים מקטעי רקמה ב-PBS (מלח חוצץ פוספט) ומרכיבים 5-8 מקטעים על שקופית טעונה חיובית, תוך שמירה על סדר טורי מהקדמי לאחורי ובאותו כיוון. הניחו לחלקי הרקמה להתייבש כדי להיצמד לחלוטין לשקופיות, ולאחר מכן ציירו גבול באמצעות עט הידרופובי או עט PAP.
- חדיר מקטעים עם חיץ חדירה (0.5% TBS (תריס מלח חוצץ) -טריטון) למשך 20-30 דקות. לאחר מכן שטפו חלקים 2x באמצעות TBS-triton במשך 5 דקות כל אחד.
הערה: חדירות מסייעת לחדירת נוגדנים תוך תאיים. ניתן להתאים את זמן החדירות בהתאם לעובי הרקמה וליעילות הנוגדנים. לחלופין, ניתן להגדיל את ריכוז חומרי הניקוי כדי להגביר את עוצמת החדירה. עם זאת, יש להקפיד לא לחלחל במשך זמן רב מדי, שכן שבריריות הרקמה עולה עם זמן חדירות ממושך.
- הכינו תמיסת תגובה של Edu (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) לפי טבלה 1. הריכוז הסופי של Alexa488-azide הוא 15 מיקרומטר ב 1 מ"ל של תמיסת תגובת אדו.
- יש לדגור על מקטעים בתמיסת תגובת Edu למשך 30 דקות עד שעה ולאחר מכן לשטוף 3x ב-TBS-טריטון למשך 5 דקות כל אחד. לאחר שלב זה, כסו את המגלשות ברדיד אלומיניום כדי להגן עליהן מפני אור. בשלב זה, בדוק אם תגובת Edu פועלת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תאים המסומנים ב-Edu יפלואורסצנטי תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי.
- פרוטוקול קטע רקמות רכובות
- חסום קטעי רקמות שהורכבו על שקופית משלב 1.1.4 באמצעות חיץ חוסם שגדל באותן חיות כמו הנוגדן המשני, למשל נסיוב חמורים, למשך 30 דקות עד שעה ולאחר מכן שטף 2x ב- TBS-טריטון במשך 5 דקות כל אחד.
- הכינו תמיסת נוגדנים ראשונית (כלומר, אנטי-נסטין עוף) במהלך שלב החסימה על ידי ערבוב נוגדנים ראשוניים בתמיסת חיץ חוסמת בשעה 1:200. 250 μL לכל שקופית מספיקים כדי להבטיח שהרקמה שקועה לחלוטין בתמיסה.
- יש לדגור על חלקי רקמה בתמיסת נוגדנים ראשונית למשך הלילה ב-RT לאחר חסימת שטיפות. שנה שלב זה בהתאם לנוגדן העיקרי בשימוש.
הערה: אם לנוגדנים יש רקע גבוה או קשירה לא ספציפית, דגירה ב-4°C במקום RT (טמפרטורת החדר) עשויה לשפר את התוצאות. נוגדנים עם חדירה לקויה לרקמות ניתן להשאיר לדגור במשך 2 ימים במידת הצורך.
- יש לדגור על מקטעי רקמה 3x ב-TBS-טריטון למשך 5 דקות כדי להסיר עודפי נוגדנים ראשוניים. לאחר מכן, לדגור על קטעי רקמה בנוגדנים משניים מצומדים פלואורופור (למשל, Alexa 647 נגד עוף בשעה 1:200) שהוכנו בתמיסת חיץ חוסמת למשך שעתיים ב- RT.
- יש לדגור על מקטעי רקמה 3x ב-TBS-טריטון למשך 5 דקות כדי להסיר עודפי נוגדנים משניים ולמרוח תמיסת DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) ב-1:100 ב-PBS למשך 15 דקות ב-RT.
- יש לדגור על חלקי רקמה 3x ב-PBS למשך 5 דקות כדי להסיר עודפי DAPI ולהסיר את עיגול עט הפאפ מרחבי הרקמה באמצעות צמר גפן או מגבון משימה עדין. הניחו למקטעים להתייבש ולאחר מכן מרחו את מדיית ההרכבה ואת הכיסוי. הניחו למדיית ההרכבה להתייבש לפני החלקות ההדמיה.
טבלה 1: פתרונות המשמשים לאימונוהיסטוכימיה
| תמיסת נוגדי הקפאה | אתילן-גליקול 150 מ"ל + סוכרוז 150 גרם + מילוי עד 500 מ"ל 0.1 מ"ל PB לתמיסה של 500 מ"ל |
| מאגר ציטראט | 9 מ"ל של ציר חומצת לימון + 41 מ"ל של מאגר טרי-נתרן ציטראט + 450 מ"ל של ddH2O |
| ציר חומצת לימון | [0.1 מטר] חומצת לימון 21 גרם/1 ליטר ddH2O |
| ציר טרי-נתרן ציטראט | [0.1 מטר] טרי-נתרן ציטראט 29.4 גרם/1 ליטר ddH2O |
| טריס חוצץ מלוחים -טריטון (TBS -טריטון) | 0.05% 100-x טריטון ב-TBS |
| מאגר חדירות | 0.5% 100-x טריטון ב-TBS |
| מאגר חוסם | 0.33 מ"ל סרום חמורים ב-10 מ"ל TBS-Triton |
| פתרון תגובת Edu | הכינו תמיסת CuSO4·5H2O על ידי הוספת 1 מ"ג של CuSO4·5H2O בתמיסת 4 מ"ל של [0.1 מ'] Tris pH 8.5. לאחר מכן יש להוסיף 1:40 של תמיסת Alexa488-azide בגודל 600 מיקרומטר ו-10 מ"ג/מ"ל של L-Na+ ascorbate לתמיסת CuSO4·5H2O לפני החלתה על רקמות. |