$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. תחזוקת תרבית תאי מיקרוגליה
- מדיום תרבית תאים חמה (מדיום הנשר המעובד של דולבקו; DMEM) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין/נאומיצין (PSN) עד 37°C.
- קבל מלאי קפוא של תאי מיקרוגליאה BV2 במעבר 18 - 25 מאחסון ב -80 ° C. להפשיר במהירות תאים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
- מעבירים בעדינות תאים לבקבוק מאווררבגודל 75 ס"מ המכיל 10 מ"ל תרבית תאים.
- יש לדגור על בקבוק ב-5% CO2 ב-37°C. יש לשאוף מדיה לאחר 24 שעות ולהחליף בחומרי הדפסה טריים. לגדל תאים עד כ 70 - 80% מפגש.
2. ספירה וציפוי תאים
- באמבט מים של 37°C, DMEM חם ותמיסת חומצה 1x-trypsin-Ethylenediaminetetraacetic (EDTA).
- לשאוף מדיה מתאים ולהוסיף 500 μl של טריפסין. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 2-5 דקות.
- באמצעות מגרד, להסיר תאים מן הבקבוק להשעות ב 5 מ"ל של DMEM. מעבירים תאים דרך מסננת של 70 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מ"ל שלוש פעמים.
- ספרו תאים באמצעות המוציטומטר וזרעו 8,000 תאים/באר בלוח תחתון שקוף בעל דופן שחורה בנפח סופי של 200 μl DMEM בתוספת 10% FBS ו-1% PSN. יש לדגור על הצלחת ב-5% CO2 ב-37°C למשך 24 שעות.
- הסר DMEM ישן והחלף אותו עם 200 μl של DMEM מחומם בתוספת 1% PSN כדי להרעיב מיקרוגליה בסרום. יש לדגור על הצלחת ב-5% CO2 ב-37°C למשך 24 שעות.
3. הפעלת מיקרוגליה
- בצינורות נפרדים, יש לדלל ננו-חלקיקי כסף (AgNPs) (0.01, 0.05 או 0.1 מיקרוגרם/מ"ל) ובקרת רכב/ניטרלי (נתרן ציטראט, 0.04 מילימול) ב-DMEM ללא סרום בתוספת 1% PSN לריכוזי העבודה הסופיים.
- הסר 100 μl של מדיה מכל באר והחלף ב 100 μl של תרכובת טיפול מתאימה.
- יש לדגור על הצלחת ב-5% CO2 ב-37°C למשך 24 שעות.
4. סינון מדיה מותנית
- לאסוף 200 μl של supernatant מדיה מכל באר ולהעביר אותו לתוך מסנן (חיתוך משקל מולקולרי של 10 kDa) עם צינור איסוף (קיבולת 1.5 עד 2 מ"ל).
- צנטריפוגה במהירות 14,000 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- השליכו את הזרימה (סופרנאטנט עם חלקיקים) והניחו את המסנן הפוך לתוך צינור איסוף חדש.
- צנטריפוגה במהירות 1,000 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות
הערה: המדיה המסוננת המתקבלת (המכילה ציטוקינים מופרשים) מרוכזת פי שישה.
- הביאו את נפח התרכיז ל-400 מיקרוליטר עם DMEM טרי בתוספת 10% FBS ו-1% PSN ואחסנו על קרח.
5. תחזוקת תרבית תאים היפותלמית
- תרבית תאי DMEM חמה בינונית בתוספת 10% FBS ו-1% PSN עד 37°C.
- קבל מלאי קפוא של תאי היפותלמוס (mHypo-A1/2) במעבר 18 - 25 מאוחסן ב 80 ° C. במהירות להפשיר את התאים באמבט מים 37 ° C.
- מעבירים בעדינות תאים לבקבוק מאווררבגודל 75 ס"מ המכיל 10 מ"ל תרבית תאים.
- יש לדגור על בקבוק ב-5% CO2 ב-37°C. יש לשאוף מדיה לאחר 24 שעות ולהחליף בחומרי הדפסה טריים. לגדל תאים עד שהם בערך ב 70 - 80% confluency.
6. קביעת רעילות תאי ההיפותלמוס
- DMEM חם ותמיסת 1x-טריפסין-EDTA באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
- לשאוף מדיה מתאי ההיפותלמוס ולהוסיף 500 μl של טריפסין. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 2-5 דקות. הסר תאים מהבקבוק באמצעות מגרד, כמתואר לעיל בשלב 2.
- ספירת תאים באמצעות המוציטומטר ותאי היפותלמוס צלחת ב 5,000 תאים / באר בלוח תחתון שחור דופן שקופה בנפח סופי של 200 μl DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% PSN, ודגור לילה ב 5% CO2 ב 37 ° C.
- הסר 100 μl של מדיה ישנה באמצעות פיפטור רב ערוצי והוסף 100 μl של מדיה ממוזגת מרוכזת מסוננת לריכוז סופי של 1x.
- יש לדגור על הצלחת ב-5% CO2 ב-37°C למשך 24 שעות.
- הוסף 22 μl של מגיב resazurin ולדגור צלחת במשך 20 דקות ב 5% CO2 ב 37 ° C.
- באמצעות ספקטרופוטומטר רב-מצבי, רשום פלואורסצנטיות (560 ננומטר EX/590 ננומטר EM) כדי למדוד את כדאיות התא. דווח על תוצאות כיחידות פלואורסצנטיות יחסיות (RFU).