פגיעה מכנית בזחלי דרוזופילה עצבים סגמנטליים כדי לגרום לניוון עצבי

תקציר

מקור: Danella, E. B., et al. מתודולוגיה פשוטה של פגיעה מכנית עצבית לחקר ניוון נוירונים מוטוריים של דרוזופילה. J. Vis. Exp. (2017).

הסרטון מדגים גרימת ניוון עצבי בעצבים סגמנטליים של זחל דרוזופילה באמצעות פגיעה מכנית. הציפורן הגחונית של זחלים מורדמים נצבטת באמצעות מלקחיים כדי לגרום לפגיעה בעצבים הסגמנטליים. הזחלים הפגועים נשמרים עם מזון, מה שמאפשר לפגיעה לגרום לניוון של הנוירונים המוטוריים בעצבים, ולגרום להפרעה בצמתים העצביים-שריריים שלהם (NMJs).

פרוטוקול

1. הכנת ריאגנטים וציוד

1. הכן 1x מאגר חיתוך (70 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 0.02 מ"מ CaCl₂, 20 מ"מ MgCl₂, 10 מ"מ NaHCO₃, 115 מ"מ סוכרוז, 5 מ"מ טרהלוז, 5 מ"מ הידרוקסיאתילפיפרזין אתאן חומצה סולפונית [HEPES]; pH 7.2).
2. הכן 1x תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS).
3. הכן 1x PBT באמצעות 1x PBS עם 0.01% Triton X-100.
4. מכינים צלחות אגר מיץ פירות.14 בקצרה, מערבבים 30 גרם אגר ב -700 מ"ל של H₂O וחיטוי. ממיסים 0.5 גרם מתיל פרבן ב -10 מ"ל אתנול ומוסיפים תמיסה ל -300 מ"ל תרכיז מיץ פירות (ענבים או תפוח). מערבבים תרכיז לתמיסת אגר חיטוי ויוצקים למכסים של צלחות פטרי בגודל 10 מ"מ על 35 מ"מ.
   הערה: ניתן לרכוש פרמיקס כוח אגר ענבים גם מחברות שונות ( ראה טבלת חומרים).
5. השג מלקחיים בגודל 5 המאפשרים לפצוע מכנית את הזחלים.
6. השתמש במכשיר הרדמה מבוסס Drosophila CO₂.

2. בחירת זחלי דרוזופילה

1. קחו בקבוקון או בקבוק של דרוזופילה המכילים זחלי כוכב שלישי נודדים שגודלו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
2. בחר עשרה זחלי כוכב שני או שלישי על סמך המראה. ניתן לזהות זחלי כוכב שלישי על ידי הופעת ספירקלים מסועפים קדמיים, בעוד שזחלי כוכב שני קטנים יותר ובעלי ספירקולות קדמיות דמויות מועדון.
   הערה: ניתן לזהות שלבי זחל גם לפי תזמון. בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, זחלי הכוכב השני מופיעים כ-48 שעות לאחר הבקיעה, וזחלי הכוכב השלישי נמסים כ-24 שעות לאחר מכן. אם מעוניינים לבחון ניוון עצבי ב-NMJ, זחלי כוכב שני צריכים להיפצע.

3. הכנת זחלי דרוזופילה לפגיעה מכנית

1. הרם בזהירות זחלים בודדים בעזרת מלקחיים או מכחול, היזהר לא לדחוס אותם בשום צורה.
2. הנח ישירות עשרה זחלים בכלי זכוכית המכיל 1X PBS קר או מאגר דיסקציה כדי להסיר שאריות מזון ולהאט את תנועתיות הזחלים.

4. פגיעה מכנית וטיפול בזחלי דרוזופילה

1. הנח כל זחל בודד על מכשיר הרדמה CO₂.
2. תחת מיקרוסקופ מנתח, גלגלו בזהירות כל זחל על הצד הגבי שלו על מנת לדמיין את העצבים הסגמנטליים דרך הציפורן.
3. מקם מלקחיים בגודל 5 בערך 1/2 עד 2/3 לאורך הזחל החל מווי הפה. לאחר המיקום, צבט כ-1/3 מהציפורן הגחונית המכילה את העצבים הסגמנטליים עם מלקחיים בגודל 5.
   1. כדי להבטיח שהעצבים הסגמנטליים של הזחל ייפגעו, הפעילו מספיק כוח כדי לרסק את העצבים הסגמנטליים אך השאירו את הקוטיקולה שלמה. כדי לקבוע את כמות הכוח הנכונה, כתוש 10 זחלים וודא ששיעור התמותה לאחר 5 שעות הוא מתחת ל-50%.
4. לאחר הפציעה, העבירו בזהירות את הזחלים לצלחת אגר מיץ פירות המכילה כ- 0.5 גרם רסק שמרים. מניחים כל זחל כך שהקצה הקדמי שלו יהיה על משחת השמרים, להמשך האכלה למרות תנועתיות מופרעת.
   הערה: כדי להבטיח שהעצבים הסגמנטליים של הזחל נפגעו, ניתן להבחין בתנועתיות זחל משובשת לאחר ההעברה לצלחת האגר. זחלים פצועים משותקים למעשה מאחור למקום הפציעה, אך עדיין יכולים להזיז את קרסי הפה שלהם ולהאכיל. שיעור תמותה גבוה של בעלי חיים לאחר פציעה הוא שכיח ולכן עדיף לפצוע 20-50% יותר בעלי חיים ממה שנדרש לניסוי.
5. מניחים צלחות אגר המכילות רסק שמרים ו -10 זחלים פצועים בתחתית צלחת פטרי ריקה בגודל 100 על 15 מ"מ. כסו את צלחת הפטרי הזו, המכילה כעת את הזחלים הפגועים על צלחת אגר במגבת נייר לחה, וודאו שמגבת הנייר לא תיגע בזחלים או בצלחות האגר. מניחים את צלחת הפטרי הזו בכלי אטום גדול יותר, בטמפרטורת החדר (RT).
6. אחזר זחלים לדיסקציה לאחר תקופות מוגדרות (6, 12 או 24 שעות) לאחר הפציעה.
   הערה: כדי לבחון את ההשפעות המיידיות של פציעה על השלד התא האקסונלי, ניתן לנתח זחלים מיד לאחר הפציעה. כדי לבחון פגמים בהובלה אקסונלית, ניתן לנתח זחלים כ-6 שעות לאחר הפציעה. כ-12 שעות אחרי הפציעה אפשר לראות הצטברות של חלבונים בכל מקום, ו-24 שעות אחרי הפציעה אפשר לראות ניוון של תאי עצב מוטוריים ב-NMJ.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מספריים לניתוח מיקרו	כלי מדע עדין	15000-08
דומונט #3 מלקחיים	כלים מדעיים	11231-30	יש אנשים שמעדיפים מידה 3, בעוד שאחרים מעדיפים מידה 5
דומונט #5 מלקחיים	כלים מדעיים	11251-30	יש אנשים שמעדיפים מידה 3, בעוד שאחרים מעדיפים מידה 5
CO2 טנק אוויר	אוויר טכנולוגי	UN 1013	ניתן לרכוש מיכלים בגדלים שונים
CO2 מנגנון הרדמה	s Genesee Scientific	59-114
סיכות נירוסטה, גודל 0.1	כלי מדע עדין	26002-10
SylGard 184 סיליקון אלסטומר, בסיס וחומר ריפוי	דאו קורנינג	3097358-1004	למזיגת צלחות חיתוך
ניתוח מיקרוסקופ סטריאו	AmScope	SM-1BZ
מקור אור	AmScope	HL150-AY-220V
מיץ ענבים אגר פרמיקס	ג'נסי מדעי	47-102
שקופיות מיקרוסקופ	ג'נסי מדעי	29-101
כיסויי זכוכית	פישר סיינטיפיק	12-545-87
תיבת השירות של Thermo Scientific Nalgene	פישר סיינטיפיק	03-484C	משמש ליצירת תא לח לשחזור זחלים