יצירת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית במודל עכבר

תקציר

מקור: Tietz, S. M. et al. Visualizing Impairing of the Endothelial Barriers and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in vivo. J. Vis. Exp.(2019)

סרטון זה מדגים את השיטה של גרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) על ידי הזרקת אדג'ובנט לפפטידים שמקורם במיאלין כדי להפעיל תאי T אוטו-ריאקטיביים, הנודדים למוח. רעלן השעלת ניתן כדי להגביר את חדירות מחסום הדם-מוח, ומאפשר לתאי T אלה ולתאי חיסון אחרים להיכנס למוח. תאים חיסוניים אלה גורמים לדמיאלינציה, מה שמוביל לפגיעה בהולכה עצבית ובהתפתחות של EAE.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. אינדוקציה EAE

1. הרדימו עכברי C57BL/6 עם איזופלואורן באמצעות מערכת וופורייזר. כדי לגרום להרדמה בעכברים, חשוף את העכבר ל -4.5% איזופלואורן בחמצן בתא דגירה קטן לפני העברת העכבר למסכת פנים עם 2.1% איזופלואורן. השתמש ביחידת הרדמה המצוידת בכרית חימום כדי למנוע היפותרמיה של העכבר.
2. תקן את העכבר המרדים ביד אחת והזריק תחילה 30 μL של גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין (MOG)-פפטיד aa_35-55 (MOG_35-55)/ השלם את תחליב האדג'ובנט (CFA) של פרוינד באופן תת-עורי לתוך אגפי הרגליים האחוריות (איור 1: 1 + 2; בסך הכל 60 μL; אגף שמאל 30 μL ואגף ימין 30 μL) בסמיכות לבלוטות הלימפה המפשעות.
3. הניחו את העכבר על בטנו והזריקו 20 μL של תחליב MOGaa_35-55/CFA לתוך רקמת השומן הרכה השמאלית והימנית בשורש הזנב (איור 1: 3+4; בסך הכל 40 μL; שורש זנב בצד שמאל 20 μL ושורש זנב בצד ימין 20 μL) וטיפה קטנה של תחליב MOGaa_35-55/CFA לתוך צוואר העכבר (איור 1: 5).
4. הזריקו 100 מיקרוליטר של תמיסת רעלן שעלת (PTx) תוך צפקית לתוך העכבר. החזק את ראשו של העכבר מתחת למרכז הגוף כדי למנוע הזרקה לתוך המעי.
5. החליפו את דיאטת התחזוקה (אקסטרודאט חומרים מזינים עיקריים: חלבון גולמי 18.5%; שומן גולמי 4.5%; סיבים גולמיים 4.5%; אפר גולמי 6.5%; עמילן 35%; אנרגיה מטבולית: 13.1 MJ / ק"ג) לתזונה רבייה (אקסטרודאט חומרים מזינים עיקריים: חלבון גולמי 23.5%; שומן גולמי 5.5%; סיבים גולמיים 3%; אפר גולמי 5.7%; עמילן 36%; אנרגיה מטבולית: 14.3 MJ / kg) על מנת לספק לעכברים מזון בעל תכולת אנרגיה גבוהה יותר לפני ובמהלך המחלה הקלינית הצפויה.
6. הסירו את מסכת הפנים והעבירו את העכבר לכלוב הביתי שלו עם כרית חימום. לאחר 10 דקות, ודאו שהעכבר ער לחלוטין ותנועתי.
7. חזור על הזרקת PTx (שלב 1.4) 48 שעות לאחר הטיפול הראשון.

2. ניקוד עכברי EAE

1. בדוק את המצב הבריאותי של עכברי EAE בכל בוקר על ידי התבוננות בתוך הכלובים.
2. ציון עכברי EAE בכל אחר הצהריים.
3. הוציאו מהכלוב כל עכבר בודד שנכלל בניסוי EAE ובדקו אם לזנב יש טונוס על ידי הזזתו כלפי מעלה עם אצבע. עכבר בריא ישמור על זנבו למעלה (לזנב יש טונוס). אם EAE קליני התחיל, טונוס הזנב יהיה נמוך יותר, נראה על ידי ירידה הדרגתית של הזנב. בסופו של דבר, העכבר לא יוכל להרים את זנבו כלל.
4. הניחו כל עכבר בודד שנכלל בניסוי EAE על הספסל הנקי והתבוננו ותיעדו את התנהגות ההליכה. ראו טבלה 1 לקריטריונים לניקוד להערכת חומרת המחלה (ציון EAE).
5. להעריך ולתעד את משקלו של כל עכבר שנכלל בניסוי.
6. כדי להבטיח ספיגה נאותה של מזון ומים על ידי עכברים המציגים ציון EAE קליני של 1, יש לספק מזון לח בכלי פלסטיק בתחתית הכלוב ולהתרענן מדי יום.

תוצאות

איור 1: ייצוג גרפי של אתרי הזרקה להשראת EAE. 1) אתר הזרקה עבור תחליב MOG 30 μL לאגף הימני, 2) אתר הזרקה עבור תחליב MOG 30 μL לאגף שמאל, 3) אתר הזרקה עבור תחליב MOG 20 μL לשורש הזנב השמאלי, 4) אתר הזרקה עבור תחליב MOG 30 μL לשורש הזנב הימני, 5) אתר הזרקה לטיפה קטנה של תחליב MOG לצוואר.

טבלה 1: קריטריונים לניקוד להערכת חומרת מחלת EAE.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מזון רבייה	לדוגמה PROVIMI KLIBA SA	3336
כלובים מאווררים בנפרד, קו כחול סוג II או III	לדוגמה Tecniplast	1145T, 1285 ליטר
נקבות עכברי C57BL/6J (8-12 שבועות)	לדוגמה, Janvier Labs		נשים, 8-12 שבועות
מחט הזרקה 18G x 11/2'' (1.2 מ"מ x 40 מ"מ)	לדוגמה BD, BD Microlance 3	304622
27G x 3/4'' – מס' 20 (0.4 מ"מ x 19 מ"מ) מחט הזרקה	לדוגמה BD, BD Microlance 3	302200
מחט הזרקה 30G x 1/2'' (0.3 מ"מ x 13 מ"מ)	לדוגמה BD, BD Microlance 3	304000
אדג'ובנט לא שלם של פרוינד (IFA)	לדוגמה סנטה קרוז ביוטכנולוגיה	SC-24648	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C
מזון תחזוקה	לדוגמה PROVIMI KLIBA SA	3436
MOGaa35-55 פפטיד	לדוגמה, GenScript		יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C
Mycobacterium tuberculosis H37RA	לדוגמה BD	231141	יש לאחסן ב-4°C
NaCl 0.9	ב. בראון	3535789
Omnican 50 30G x 1/2''	ב. בראון	9151125S
רעלן שעלת	לדוגמה, List biological laboratories, Inc.	180	יש לאחסן ב-4°C
מספריים לתפור	פ.ס.ט	15012-12
מזרק 1 מ"ל	לדוגמה PRIMO	62.1002
מזרק 10 מ"ל	לדוגמה, CODAN Medical ApS	2022-05

%