Immunostaining של רקמות Craniofacial עכבר

תקציר

מקור: Yang, J., et al., Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissue and Undecalcified Bone. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את צביעת האימונופלואורסצנטיות של קריוסקציות מרקמות גולגולתיות עובריות של עכברים, תוך שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להעריך את ביטוי הסמנים הגרעיניים ולקבוע את התפשטות התאים ואת פעילות האיתות.

פרוטוקול

טקסט כתב ויתור: כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. צביעת אימונופלואורסנציה

1. הוציאו מגלשות מ-80°C-. שמרו את המגלשות ב-RT למשך שעה אחת למקטעים יבשים. יש לשטוף שקופיות ב-0.1% PBST (0.1% פוליאתילן גליקול טרט-אוקטילפניל אתר ב-PBS; ראו טבלת חומרים) שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת כדי לשטוף OCT ולחדור למקטעים.
2. לחלופין, בצע אחזור אנטיגן (אופציונלי).
   1. מחממים את מאגר הציטראט (10 מ"מ נתרן ציטראט pH 6) בצלחת הצביעה עם אידוי או אמבט מים ל 95-100 מעלות צלזיוס. טובלים את המגלשות במאגר הציטראט ודגרים במשך 10 דקות.
   2. הוציאו את צלחת הכתמים ממכשיר הקיטור או מאמבט המים וקררו את המגלשות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות או יותר15.
      הערה: כחלופה, השתמש במאגר Tris-EDTA (בסיס Tris של 10 mM, 1mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 9.0) או במאגר EDTA (1 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 8.0) לאחזור אנטיגן המושרה בחום. השתמשו בסיר לחץ, מיקרוגל או אמבט מים לשליפת אנטיגן הנגרם מחום בנוסף למכשיר הקיטור החם. שליפת אנטיגן המושרה על ידי אנזים באמצעות טריפסין או פפסין היא חלופה נוספת. מטב את הריכוז ואת זמן הטיפול של שליפה אנזימטית כדי למנוע פגיעה בקטעים. אופטימיזציה של שיטת אחזור האנטיגן עבור כל שילוב נוגדן/אנטיגן.
3. יש לדגור על כל שקופית עם 200 מיקרוליטר של תמיסת חסימה (5% סרום חמור מדולל ב-0.1% PBST) ב-RT למשך 30 דקות, ולאחר מכן להסיר את התמיסה החוסמת ללא שטיפה.
4. יש לדגור על כל שקופית עם 100 μL של נוגדנים ראשוניים או נוגדנים מדוללים בתמיסת חסימה למשך שעה אחת ב-RT או O/N ב-4°C. שטפו שקופיות עם PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחת ב-RT.
5. דגרו על כל שקופית עם 100 μL של נוגדן משני מדולל בתמיסת חסימה למשך שעה אחת ב-RT. שטפו שקופיות ב-PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחת ב-RT. הגנו על שקופיות מפני אור.
6. הר מגלשות.
   1. הוסף שתי טיפות של מדיום נגד דהייה עם DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) בשקופית. לאחר מכן מכסים בכיסוי.
   2. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C בחושך עד לקבלת תמונה.
      הערה: כחלופה, יש לסמן את הגרעינים בצבע DAPI או Hoechst 33324 מדולל ביחס 1:2,000 ב-PBS ב-RT תחילה, ולאחר מכן להרכיב עם גליצרול.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Alexa fluor 488-goat נוגדן משני נגד ארנב	Invitrogen	A-11034
הרכבה נגד דהייה עם DAPI	Invitrogen	P36931
אלבומין בסרום בקר	סיגמא	A2153
כיסויים	פישר ברנד	12-545-E
קריוסטט	לייקה	CM1850
EDTA	סיגמא	E6758
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	אולימפוס	BX51
שקופיות מיקרוסקופ	פישר ברנד	12-550-15
מתחם OCT	פישר הלת'	23-730-571
פרפורמאלדהיד (PFA)	סיגמא	עמ' 6148
מלח חוצץ פוספט (PBS)	סיגמא	עמ' 4417
אתר פוליאתילן גליקול טרט-אוקטילפניל	סיגמא	T9284	טריטון X-100
נוגדן ארנב נגד Ki67	טכנולוגיית איתות תאי	9129	לוט#:3; RRID:AB_2687446
נוגדן ארנב נגד pSmad1/5/9	טכנולוגיית איתות תאי	13820	לוט#:3; RRID:AB_2493181
נתרן ציטראט	סיגמא	1613859
טריס	סיגמא	10708976001