הדמיה של תנועתיות שלפוחית בתאי עצב באמצעות הדמיה פלואורסצנטית

Abstract

מקור: Tsuruta, F., et al. כימות של תנועתיות אנדוזום וליזוזום בתאי עצב בתרבית באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים כיצד שלפוחיות עצביות מסומנות בחלבונים פלואורסצנטיים ספציפיים כדי לדמיין את תנועתן. ראשית, פלסמיד המקודד לחלבון פלואורסצנטי מודגר עם סוכן טרנספקציה ולאחר מכן מוכנס לתרבית של נוירונים. לאחר מכן, תמונות של הנוירונים נרכשות ומנותחות כדי לעקוב אחר תנועת השלפוחיות.

Protocol

1. הדמיה תנועתיות שלפוחית

1. הכינו את הפלסמידים שיתייגו כל סוג שלפוחית. לדוגמה, השתמשו ב-EGFP-Rab5 עבור אנדוזומים מוקדמים, ב-EGFP-Rab7 עבור אנדוזומים מאוחרים, ב-LAMP-EGFP עבור ליזוזומים, וב-EGFP-LC3 עבור אוטופגוזומים.
   הערה: פלסמידים אלה זמינים על פי בקשה tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp. בדרך כלל, 3 -5 ימים במבחנה (חלוקה או DIV) נוירונים יכולים להיות נגועים עם פלסמידים אלה באמצעות ריאגנטים transfection.
2. מערבבים 4.0 מיקרוגרם של פלסמידים עם 200 μL של מדיום ללא סרום על ידי pipetting. בצינור נפרד, לדלל 8 μL של מגיב transfection (ראה טבלה של חומרים) ב 200 μL של תווך ללא סרום. יש לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
3. ערבבו את תמיסת הפלסמיד ואת תמיסת הטרנספקציה בשלב 1.2 על ידי פיפטציה. דגירה במשך 20 דקות ב- RT.
4. הוסף מדיום ללא סרום ו 400 μL של תמיסת פלסמיד משלב 1.3 לכל צלחת מצופה זכוכית תחתית המכילה נוירונים קליפת המוח, מדיום קליפת המוח. לדגור את הנוירונים ב 37 ° C ב 5% CO₂ אינקובטור במשך 30 דקות. החלף את המדיום עם 2 מ"ל של מדיום תרבות קליפת המוח. לדגור את הנוירונים ב 37 ° C ב 5% CO₂ אינקובטור במשך 1-2 ימים.
   הערה: הכינו מדיום תרבית קליפת המוח המורכב ממדיום בסיסי של נוירון בתוספת תוספי B-27 1x, 2 מילימ"ר L-גלוטמין ו-100 U/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין.
5. לאחר 1 - 2 ימים של טרנספקציה, בחר את התאים transfected עבור רכישת תמונה.
   הערה: לתאי עצב מוקדמים פחות מ-7 DIV יש נטייה להפגין תנועתיות שלפוחית דינמית. בחר תאי עצב המבטאים באופן מתון את הבדיקה הפלואורסצנטית מאחר שלא ניתן לקבל תמונות ברורות כאשר נבחר נוירון בעל ביטוי גבוה. כמו כן, בחרו צורה עצבית טיפוסית, כמו למשל תאי עצב פירמידליים, שיש להם אקסונים ארוכים ודנדריטים מורכבים, כדי לזהות בקלות את האקסון והדנדריטים (ראו איור 1A).
6. רכישת תמונה באמצעות מערכת הדמיה בהילוך מהיר: להדמיה, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במצלמת CCD (Charge-Coupled Device) עם עדשות אובייקטיביות 40X Plan Apo 0.95NA או 100X Plan Apo VC NA1.4. שלוט בטמפרטורה ב 37 °C באמצעות מערכת הדגירה. קבל תמונות נוירונים בפריים אחד / 5 שניות במשך תקופה של 100 שניות הנשלטת על ידי תוכנת רכישת התמונות. לחלופין, רכשו תמונות בפרקי זמן קצרים יותר ולפרקי זמן ארוכים יותר, כגון פריים אחד לכל 2 שניות על פני תקופה של 300 שניות.
   הערה: מגוון יישומים זמינים לצילום תמונות רציפות, שרבות מהן יתאימו לשיטה זו. לכן, לא מומלץ יישום מסוים; במקום זאת, כל חוקר צריך להשתמש בכל יישום זמין.

2. ניתוח תמונות

1. פתח את כל התמונות הרציפות בתוכנת ImageJ עם Manual Tracking.
   הערה: עד כה, מעקב ידני היה בשימוש נרחב במעקב אחר ניסויים. מעקב ידני פותח על ידי ד"ר פבריס קורדלייר. הוראות מפורטות בכתב זמינות באינטרנט. לצורך הניתוח, איכות נתוני ההדמיה משופרת עם מספר מספיק של תמונות. מומלץ להשתמש ביותר מ -20 תמונות.
2. לשילוב התמונות הרציפות, בחרו→ → . לחץ.
3. בחר → ; חלון מעקב יופיע.
4. לחץ על תיבת הסימון של והגדר את פרמטרי המעקב בסעיף הפרמטרים.
   הערה: ניתן להגדיר מספר פרמטרים, כולל מרווח זמן, כיול x/y, כיול z, גודל ריבוע חיפוש עבור מרכוז, גודל נקודה, רוחב קו וגודל גופן. בבדיקה פשוטה זו הוגדרו הן מרווח הזמן והן כיול x/y. בנסיבות ניסוי אחרות, ייתכן שיהיה צורך להגדיר גם פרמטרים אחרים. הפרמטרים המשמשים כאן הם כדלקמן: הוא 5 שניות, וה- הוא 0.26642 מיקרומטר עבור עדשת 40X Plan Apo 0.95NA אובייקטיבית או 0.10657 מיקרומטר עבור עדשת 100X Plan Apo VC NA1.4 אובייקטיבית.
5. לאחר הגדרת הפרמטרים, לחץ על כדי להתחיל מסלול חדש.
6. לאחר קביעת הבועיות המעניינות (למשל, השלפוחיות המסומנות על-ידי ראשי חץ כחולים ואדומים באיור 1A (פאנל ימני)), לחצו על מרכז האותות בתמונות הרציפות כדי להקליט את קואורדינטות xy. התוצאות של קואורדינטות xy שהוקלטו, המרחק והמהירות מופיעות בחלון חדש.
   הערה: במקרה של ליזוזומים, אותות פלואורסצנטיים בהירים גדולים (למשל, איור 1A (פאנל ימני), ראש חץ כתום) נצפים לעתים קרובות בתאי עצב. אותות אלה מציגים מדי פעם שלפוחיות מצטברות או דליות פתולוגיות, ולכן יש להימנע מאותות אלה לצורך כימות תנועתיות.
7. חזרו על שלב 2.6 כדי לאסוף את קואורדינטות xy של שלפוחיות מכל התמונות הרציפות. לאחר בחירת נקודת ההתייחסות, כל תמונה מתקדמת אוטומטית לתמונה העוקבת.
8. יצא נתונים אלה לטבלה חדשה (לדוגמה, גיליון אלקטרוני). השתמש בתוכנה מתאימה ליצירת גרף מתאים (ראה טבלת חומרים).
   הערה: כדי לנתח את הנתונים, בחר את העמודה, סכם את כל הערכים של עמודה זו והצג מרחק תנועתיות כתרשים עמודות, כגון באיור 1B. בנוסף, חזרו על שלב זה, חשבו את הממוצע של מרחק התנועה הכולל, והציגו כגרף עמודות, כמו באיור 1C. התוכנה ליצירת גרף עמודות ונתוני צורת גל מוצגת בטבלת החומרים.

Results

איור 1: תנועתיות ליזוזום בדנדריטים עצביים. (A) נוירונים בקליפת המוח של עכבר (4 DIV) היו נגועים בפלסמיד LAMP-EGFP במשך יומיים. תמונה זו מראה את תנועתיות השלפוחיות המכילות LAMP-EGFP בדנדריטים. הכניסה מציגה את תמונת קיטועי הזמן של שלפוחיות LAMP-EGFP חיוביות. ראש החץ האדום מציין שלפוחית נעה, וראש החץ הכחול מציין שלפוחית מנוחה. ראשי החץ הכתומים מצביעים על אותות פלואורסצנטיים גדולים יותר, כפי שהוזכר לעיל. ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מדיום נוירובזאלי	תרמו פישר	21103-049
Opti-MEM	תרמו פישר	31985070	ללא סרום בינוני
פניצילין סטרפטמיצין	תרמו פישר	15140122
ל-גלוטמין	תרמו פישר	25030081
תוספי B-27	תרמו פישר	17504044
פולי-D-ליזין הידרוברומיד	סיגמא	P7280
פולי-L-אורניתין	סיגמא	עמ' 4957
ליפופקטמין 2000	תרמו פישר	11668027	מגיב טרנספקציה
Polyethyleneimine "מקס"	מדעי העל	24765	מגיב טרנספקציה. כחלופה Lipofectamine2000, 0.1mg / ml פוליאתילנימין מומס במים מעוקרים זמין. אבל זה יעילות נמוכה ורעילות גבוהה.
BIOREVO BZ-9000	קיינס	נה
מערכת אינקובציה INUG2-K13	טוקאי היט	נה
GraphPad פריזמה גרסה 6.0	תוכנת GraphPad	נה
Excel גירסה 15	מיקרוסופט	נה
ImageJ verion 1.47	נה	נה