$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.
1. אימונופלואורסנציה
- הכינו תמיסות, כולל מאגר חוסם, מאגר נוגדנים, חיץ כביסה 1 ומאגר כביסה 2 (ראו טבלה 1).
- שטפו פרוסות פעם אחת עם מאגר פוספט (PB) כדי להסיר תרכובת עודפת של טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT).
- מוציאים את התמיסה עם פיפטה מפלסטיק מבלי למצוץ את פרוסות המוח. הוסף 250 μL של PB טרי עם פיפטה 1000 μL.
זהירות: פרוסות לא צריך להתייבש, אז להסיר ולהוסיף נוזלים היטב על ידי היטב.
- הסר את PB עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף 250 μL של חיץ חוסם לכל באר עם פיפטה 1000 μL. יש לדגור במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר (RT) על השייקר.
- במהלך זמן הדגירה, לדלל את הנוגדנים הראשוניים במאגר נוגדנים בצינור תגובה. השתמש במאגר נוגדנים של 250 μL לכל באר והוסף את כמות הנוגדנים המתאימה (ראה טבלה 2) על ידי הזרמתו ישירות לתמיסה באמצעות פיפטה של 2 μL. מערבבים את התמיסה על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה מספר פעמים. מערבולת זמן קצר לאחר מכן כדי להבטיח ערבוב נכון.
הערה: כדי לקבוע את פלואורסצנטיות הרקע, יש לבצע צביעה גם מבלי להוסיף את הנוגדן הראשי. לשם כך, לדגור על הפרוסה בתמיסת נוגדנים ללא נוגדנים ראשוניים על פי הפרוטוקול.
- לאחר זמן הדגירה, להסיר את החיץ החוסם עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף 250 μL של תמיסת נוגדנים המכילה נוגדנים ראשוניים לכל באר. יש לדגור על פרוסות עם נוגדן ראשוני למשך הלילה ב-4°C על שייקר.
- למחרת, שטפו את הפרוסות עם חיץ כביסה 1 3x למשך 10 דקות ב-RT על שייקר.
- מוציאים את המדיום עם פיפטה פלסטיק ומוסיפים 300 μL של חיץ כביסה 1 לכל באר. יש לדגור ב-RT למשך 10 דקות. חזור על הפעולה 3 פעמים.
- במהלך שלבי השטיפה, דללו את הנוגדנים המשניים המצומדים לפלואורופור במאגר נוגדנים בצינור תגובה. השתמש במאגר נוגדנים של 250 μL לכל באר והוסף את כמות הנוגדנים המתאימה (ראה טבלה 2) על ידי הזרמתו ישירות לתמיסה באמצעות פיפטה של 2 μL. מערבבים את התמיסה על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה מספר פעמים. מערבולת זמן קצר לאחר מכן כדי להבטיח ערבוב נכון.
זהירות: מכיוון שהנוגדנים רגישים לאור, כל השלבים מנקודה זו ואילך צריכים להתבצע בחושך.
- לאחר שלבי הכביסה, הסירו את חיץ הכביסה עם פיפטה מפלסטיק והוסיפו 250 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים המכילה נוגדנים משניים לכל באר. לדגור על הפרוסות עם נוגדן משני במשך 90 דקות ב RT בחושך.
- שטפו את הפרוסות עם מאגר כביסה 2 3x במשך 10 דקות ב-RT.
- במהלך שלבי השטיפה, לדלל 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ב 0.1 M PB בריכוז של 1:2000.
- הסר את חיץ הכביסה 2 עם פיפטה פלסטיק והוסף 250 μL של תמיסת DAPI לכל באר. יש לדגור במשך 5 דקות ב-RT על השייקר.
- הסר את פתרון DAPI עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף 500 μL של 0.1 M PB לכל באר עם פיפטה 1000 μL.
- הרכיבו פרוסות על שקופיות מיקרוסקופ.
- מקם שקופית מיקרוסקופ מתחת לסטריאוסקופ. בעזרת מברשת עדינה, הוסיפו שלוש טיפות נפרדות של 0.1 מ' PB לשקופית. הניחו פרוסה אחת בכל טיפה על שקופית המיקרוסקופ.
- השתמשו במברשת העדינה כדי לשטח ולכוון את הפרוסות בשקופית המיקרוסקופ.
- כאשר כל הפרוסות ממוקמות כראוי, להסיר PB עודף עם טישו ולייבש את השקופית בזהירות.
זהירות: הימנעו מייבוש מוחלט של פרוסות המוח.
- הוסף 80 μL של מדיום הטבעה לשקופית. הורידו בזהירות את הכיסוי אל המגלשה, ובכך הטמיעו את פרוסות המוח.
- השאירו את המגלשות להתייבש במכסה האדים למשך 1-2 שעות (כסו אותן כדי למנוע חשיפה לאור) ואחסנו אותן בקופסת שקופיות במיקרוסקופ בטמפרטורה של 4°C.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
2. הדמיה
- לאחר שמדיום ההטבעה התקשה לחלוטין, מקם את שקופית המיקרוסקופ מתחת למיקרוסקופ הקונפוקלי.
הערה: מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בשילוב עם תוכנת דה-קונבולוציה אמור להניב איכות תמונה דומה.
- התאם את הגדרות הלייזר על-ידי הגדלה או הקטנה של עוצמת הלייזר לכל ערוץ, כך שפיקסלים מעטים ייחשפו יתר על המידה כדי להבטיח פיזור מרבי של ערכי האפור.
- לרכוש רקמות וירטואליות של פרוסת המוח כולה עבור הערוצים השונים.
- בתוכנת ההדמיה, בחרו באפשרות 'אריחים' ותחמו ידנית את פרוסת המוח בעזרת 'הגדרת אזור אריחים'.
- פזר נקודות תמיכה בכל אזור האריח והתאם את המוקד עבור נקודות התמיכה השונות על-ידי הקשה על אמת אזורים/מיקומים של אריחים....
- התאם את ההגדרות במצב רכישה בהתאם לרזולוציה הרצויה ולגודל הקובץ של התמונה המתקבלת והתחל בסריקה.
- בסיום הסריקה, השתמש בפונקציה Stitching כדי לעבד את הרקמה הווירטואלית. יצא את הקובץ כקובץ .tif באמצעות הפונקציה Image Export.
3. ניתוח מבוסס מחשב
- טען את כל הערוצים הבודדים עבור תמונה אחת לתוך FIJI על ידי לחיצה על קובץ| פתוח.
- בעזרת כלי הבחירה Freehand, סמן חצי כדור אחד בערוץ DAPI. צור מסיכה של הבחירה על-ידי לחיצה על ערוך | בחירה| צרו מסיכה.
- קבע את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת עבור הערוצים הבודדים (Mover ו- synaptophysin) על-ידי לחיצה על Analyze| מידה.
הערה: הקפידו לבחור את הערוצים השונים כדי לקבוע את ערכי עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת לכל ערוץ.
- העתק את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של הערוצים הבודדים לגיליון אלקטרוני.
- קבע את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת עבור ערוצים בודדים באזור עניין על-ידי תיחום האזור גם באמצעות כלי הבחירה Freehand. השתמש באטלס מוח עכבר כחומר עזר.
- חזור על שלבים 3.1-3.5 עבור כל חצאי הכדור וכל תחומי העניין.
הערה: קבע את הערכים עבור כל חצי כדור בנפרד על מנת להשוות מאוחר יותר את הערכים בתחום עניין לזה שבחצי הכדור (ראה שלב 4.2).
4. טיפול בנתונים
- במקרה שפלואורסצנטיות הרקע גבוהה, ייתכן שיהיה צורך בחיסור רקע. לשם כך, קבעו את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת עבור הפרוסה המעובדת ללא נוגדן ראשוני כנגד חלבון הייחוס (כאן: סינפטופיזין) והפחיתו ערך זה מכל הערכים המתקבלים עבור אזורי המוח וההמיספרות.
- כאשר נקבעו העוצמות הפלואורסצנטיות הממוצעות עבור התעלות הבודדות עבור כל חצי כדור וכל תחום עניין (ראה טבלה 3), חשב את היחס בין Mover לסינפטופיזין על ידי חלוקת הערך עבור Mover בערך עבור synaptophysin (צהוב בטבלה 3). בצע פעולה זו עבור כל חצי כדור וכל תחום עניין בנפרד.
- חלק את היחס המתקבל עבור אזור עניין אחד ביחס המתקבל עבור חצי הכדור המתאים (כתום בטבלה 3) כדי לקבוע את היחס בין אזור העניין לחצי הכדור.
- כדי לקבוע את השפע היחסי של המוביל, יש לתרגם את היחס המתקבל ב-4.2 לאחוז על-ידי קביעת הסטייה שלו מ-1 (אדום בטבלה 3). יחס של 1.25 ייתן אפוא שפע נעים יחסי של 25% מעל הממוצע, ויחס של 0.75 יניב שפע נעים יחסי של 25% מתחת לממוצע.
טבלה 1: פתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.
| Fixative (500mL) |
Mix 20g paraformaldehyde (סה"כ conc.: 4%)
50 מ"ל 10x PBS פתרון מניות (סה"כ conc.: 1x)
450 מ"ל bidest H2OAdjust pH עד 7.4 עם NaOH
הערה: כדי לפתור את הפרפורמאלדהיד ב-PBS, חממו את התמיסה. אין לחמם מעל 70 oC, מכיוון ש- PFA מתפורר בטמפרטורות גבוהות מ- 70 oC.
אזהרה: PFA הוא רעיל, עלול להיות מסרטן וטרטוגני. יש ללבוש כפפות בעת עבודה עם PFA ולעבוד מתחת למכסה המנוע. יש להימנע מבליעה. |
| 0.1M PB (1L) |
פתרון מלאי X
35.61 גרם Na2HPO4.2H 2O ב 1 L bidest H2O | פתרון מלאי Y
27.60 גרם NaH2PO 4.2H 2O ב 1 L bidest H2O |
Mix 385 mL פתרון מלאי X
115 מ"ל פתרון מלאי Y
500 מ"ל bidest H2O |
| מאגר חוסם (50 מ"ל) |
לערבב 1.25 מ"ל סרום עיזים רגיל (סה"כ conc.: 2.5%)
1.25 מ"ל סרום חמור רגיל (סה"כ conc.: 2.5%)
0.5 מ"ל פעילי שטח לא יוניים (Triton-X100, סה"כ קונקציה: 1%)
47 מ"ל 0.1 מטר PB |
| מאגר נוגדנים (50 מ"ל) |
מערבבים 0.25 מ"ל סרום עיזים רגיל (סה"כ conc.: 0.5%)
0.25 מ"ל סרום חמור רגיל (סה"כ conc.: 0.5%)
0.1 מ"ל פעילי שטח לא יוניים (סה"כ conc.: 0.2%)
49.4 מ"ל 0.1 מטר PB |
| חיץ כביסה 1 (50 מ"ל) |
לערבב 1 מ"ל סרום עיזים רגיל (סה"כ conc.: 2 %)
49 מ"ל 0.1 מטר PB |
| מאגר כביסה 2 (50 מ"ל) |
לערבב 0.5 מ"ל סרום עיזים רגיל (סה"כ conc.: 1 %)
49.5 מ"ל 0.1 מטר PB |
טבלה 2: נוגדנים המשמשים בפרוטוקול זה.
| נוגדנים ראשוניים |
| מכוון נגד | מינים מארחים | $$ | ריכוז |
| מוביל | ארנב | AB_10804285 | 1:1000 |
| סינפטופיזין | קביה | AB_1210382 | 1:1000 |
| נוגדנים משניים |
| מין יעד | מינים מארחים | פלואורופור | ריכוז |
| ארנב | חמור | AlexaFluor 647 | 1:1000 |
| קביה | עז | AlexaFluor 488 | 1:1000 |
טבלה 3: דוגמה לטיפול בנתונים.
| חצי כדור הארץ |
| חצי כדור # | עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת: סינפטופיזין (A.U.) | עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת (A.U.) | יחס מניע/סינפטופיזין | | |
1
2
3<בר/>
4<בר/>
5<בר/>
6 | 29.134
31.008
38.641
30.775
21.658
27.277 | 22.810
24.046
29.324
25.444
18.091
23.364 | =C3/B3 0.783
=C4/B4 0.775
=C5/B5 0.759
=C6/B6 0.827
=C7/B7 0.835
=C8/B8 0.857 | | |
| היפוקמפוס |
| חצי כדור # | עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת: סינפטופיזין (A.U.) | עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת (A.U.) | יחס מניע/סינפטופיזין | יחס לחצי כדור הארץ | שפע מניע יחסי (%) |
1
2
3<בר/>
4<בר/>
5<בר/>
6 | 35.26
33.955
41.231
39.853
30.129
28.737 | 29.889
27.825
31.978
31.787
27.817
25.861 | =C11/B11 0.848
=C12/B12 0.819
=C13/B13 0.776
=C14/B14 0.798
=C15/B15 0.923
=C16/B16 0.900 | =D11/D3 1.083
=D12/D4 1.057
=D13/D5 1.022
=D14/D6 0.965
=D15/D7 1.105
=D16/D8 1.051 | =(E11-1)*100 8.269
=(E12-1)*100 5.673
=(E13-1)*100 2.200
=(E14-1)*100 -3.528
=(E15-1)*100 10.530
=(E16-1)*100 5.064 |