Method Article

כימות התפלגות חלבון פרסינפטי במוח עכבר באמצעות אימונופלואורסנציה

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Wallrafen, R., et al. כימות ההתפלגות ההטרוגנית של חלבון סינפטי במוח העכבר באמצעות immunofluorescence. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים את הצביעה האימונופלואורסצנטית של פרוסת מוח עכבר כדי לכמת את ההתפלגות של חלבון קדם-סינפטי מסוים. התהליך כולל חסימת אתרים לא ספציפיים, החלת נוגדנים ראשוניים לחלבון המטרה וסמן ייחוס, ולאחר מכן תיוג נוגדנים משני והכתמת נגד גרעינית. סמן הייחוס מבטיח כימות מדויק על ידי מתן קו בסיס עקבי, והתפלגות החלבון הפרה-סינפטי מנותחת על פני אזורי מוח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. אימונופלואורסנציה

  1. הכינו תמיסות, כולל מאגר חוסם, מאגר נוגדנים, חיץ כביסה 1 ומאגר כביסה 2 (ראו טבלה 1).
  2. שטפו פרוסות פעם אחת עם מאגר פוספט (PB) כדי להסיר תרכובת עודפת של טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT).
    1. מוציאים את התמיסה עם פיפטה מפלסטיק מבלי למצוץ את פרוסות המוח. הוסף 250 μL של PB טרי עם פיפטה 1000 μL.
      זהירות: פרוסות לא צריך להתייבש, אז להסיר ולהוסיף נוזלים היטב על ידי היטב.
  3. הסר את PB עם פיפטה פלסטיק ולהוסיף 250 μL של חיץ חוסם לכ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 מ"ל צינורות תגובהאפנדורף30120094
צינורות תגובה של 50 מ"לגריינר ביו-וואן227261
מולטיוול 24 בארפישר סיינטיפיק087721H
פיפטה פלסטיק (חד פעמית)זארשטדט8,61,176
1000 מ"ל פיפטהריינין17014382
2 מ"ל פיפטהאפנדורף3123000012
וורטקס גאון 3איקה3340001
שקופיות מיקרוסקופ מנזלפישר סיינטיפיק10144633CF
סטריאוסקופלייקה
LSM800זיסמיקרוסקופ קונפוקלי
PBS (פי 10)רוש11666789001
טק רקמותסאקורה4583אוקטובר
נא2HPO4BioFroxx5155KG001
נה"ה 2ת.ד. 4מרק1,06,34,60,500
סרום עיזים רגילמרק מיליפורS26-100ML
סרום חמור רגילמרקS30-100ML
טריטון X-100מרק1,08,60,31,000
ארנב נגד Moverמערכות סינפטיותRRID: AB_10804285
שרקן אנטי סינפטופיזיןמערכות סינפטיותRRID: AB_1210382
חמור נגד ארנב AF647ג'קסון מחקר חיסוניRRID: AB_2492288
עז נגד עכבר AF488ג'קסון מחקר חיסוניRRID: AB_2337438
מאוויול4-88קלביוכם475904
תוכנת ZEN2 blueזיסתוכנת מיקרוסקופיה
פיג׳יImageJתוכנת ניתוח
מיקרוסופט אקסלמיקרוסופט

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Presynaptic ProteinImmunofluorescence StainingMouse BrainConfocal MicroscopyFluorescence IntensityPrimary AntibodiesSecondary AntibodiesNuclear CounterstainingBrain Slice PreparationImage Analysis Fiji

Related Articles