הערכת השלמות המבנית של הצמתים העצביים-שריריים האורכיים הגביים בדרוזופילה

1. הקפאת הבזק וחתך בית החזה

1. לפני תחילת החתכים, מלאו בקבוק דיואר בחנקן נוזלי באמצעות כפפות הגנה קריו-מגינות מתאימות ומשקפי בטיחות. השג מפסק להבים, להבי נוצות, זוג אחד של מלקחיים עדינים, קרח, PBS 1x קר כקרח ופינצטה קריוגנית.
2. הכינו דלי קרח כדי לשמור על 1x PBS קר כקרח.
3. השתמש במפסק הלהבים כדי לתפוס את להב הנוצה בזווית וכופף את הלהב כדי לשבור חתיכה קטנה. לאחר מכן מפסק הלהבים יכול לנעול את הלהב במקומו לשימוש כאזמל קטן.
   הערה: להב אחד צריך להחזיק מעמד לכל הקבוצות. החליפו אם הלהב נשבר או נעשה עמום.
4. הוסף קצה פיפטה נקי ל-P200 והסר 1/5 מהקצה כדי להעביר דוגמאות.
5. הכינו צינור מיקרוצנטריפוגה חדש לכל קבוצה והוסיפו 200 μL של 1x PBS לכל צינור. צינור שני זה ישמש לאיסוף ההכנות הסופיות של DLM.
6. הסר את כל 1x PBS מצינורות באמצעות פיפטה פסטר.
7. ללבוש ציוד מגן מתאים, לטבול את הצינור לתוך בקבוק חנקן נוזלי במשך 10 s עם פינצטה cryogenic.
   הערה: יש לסגור את הצינורות היטב כדי למנוע מהצינור להתפוצץ.
8. הסר את הצינור מהחנקן הנוזלי והוסף כ 300 μL של PBS קר כקרח 1x PBS לדגימות עם פיפטה פסטר. שמור את הדגימות על קרח.
9. הוסיפו 1x PBS קר כקרח לצלחת דיסקציה בקוטר 10 ס"מ המצופה באלסטומר סיליקון והוציאו את בית החזה הראשון עם פיפטה 200 μL שעברה שינוי.
10. הניחו את הצד הגחוני של בית החזה כלפי מעלה. ביד אחת השתמשו בזוג מלקחיים עמומים כדי למקם את בית החזה ובשנייה השתמשו בזוג מלקחיים דק כדי להסיר חלק מהגנגליון החזי כדי לחשוף את קו האמצע של בית החזה.
11. השתמש בקו האמצע של בית החזה כמדריך לביצוע חתך רדוד דרך 1/3 מבית החזה עם הלהב.
12. הסר את הלהב מבית החזה ומקם את בית החזה בזווית של 45° בעזרת המלקחיים הקהים. הכנס מחדש את הלהב וחתך ישר לאורך קו האמצע של בית החזה. התוצאה תהיה שתי המיתורצות.
13. קחו חצי בית חזה אחד בכל פעם והוציאו את הרקמה העודפת מתחת לסיב שריר DLM F (איור 1B), הסיב הגחוני ביותר. השתמש בלהב כדי לבצע בזהירות חתך אחד או שניים כדי להסיר את הרקמה העודפת מבלי לפגוע ב- DLM.
14. לאחר הבידוד, להעביר את hemithorax לצינור הנכון עם 1x PBS.
15. חזור על שלבים 1.6\u20121.14 עד לביצוע 10 hemithoraces מנותחים לכל קבוצה.

2. צביעה מבנית

1. לאחר חיתוך דגימות בית החזה, הניחו את הרקמה בחיץ חוסם (1x PBS עם 0.1% סרום עיזים רגיל, ו-0.2% Triton X-100 ב-pH 7.4) כדי לחדור לרקמה ולמנוע כתמים לא ספציפיים. השתמש פיפטה פסטר כדי להסיר עודף 1x PBS ולהוסיף 1.5 מ"ל של חיץ חוסם לכל צינור. לחסום רקמות לפחות 1 שעה ב 4 ° C.
2. הכינו את הדגימות לצביעה מבנית באמצעות נוגדן מצומד פלואורסצנטי, חזרת פרוקסידאז 488 (anti-HRP-488) בדילול של 1:200 ופאלואדין-647 בדילול של 1:1000 בחיץ חוסם להכתמת נוירונים מוטוריים ורקמת שריר, בהתאמה. לעשות מספיק כתם כדי לקבל 150 μL לכל צינור. יש לאחסן את הכתם בטמפרטורה של 4°C כשהוא מכוסה בנייר כסף או בקופסה כהה עד שהוא מוכן להכתמה.
3. לאחר החסימה, הסר את מאגר החסימה העודף עם פיפטה פסטר זכוכית.
4. לפני הסרת הכתם המבני, מערבלים את הכתם. הוסף 150 μL של הכתם לכל צינור. הניחו את הדגימות בקופסה כהה על המסובב בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.
5. הסר את הכתם ושטוף את הרקמות ארבע פעמים ב 1.5 מ"ל של טמפ' החדר 1x PBS עם 0.3% Triton X-100 במשך 5 דקות על המסובב בקופסה כהה. הדגימות מוכנות כעת להרכבה על שקופית.

3. רקמת הרכבה

1. לאחר שטיפת דגימות ב-PBST, הכינו שקופית מיקרוסקופ להרכבת רקמה לצביעה. הכינו ציוד נוסף כולל החלקות כיסוי זכוכית, פיפטה P200, קצוות פיפטה 200 μL, מספריים, חיזוקים שקופים, מלקחיים בעלי קצה ישר, אמצעי הרכבה פלואורסצנטיים נגד דהייה, לק וקופסה כהה לכיסוי המגלשות.
2. תייגו את השקופית כדי לזהות את הדגימות ונקו אותה עם מגבוני קים כדי להסיר כתמים.
3. כדי להבטיח שחלקת הכיסוי לא תפגע בדגימות חצי החזה, בנו "גשר" באמצעות תוויות חיזוק. חותכים תווית חיזוק אחת לשניים ומניחים כל חצי במרחק של כ-15 מ"מ זה מזה. מרחק זה חייב להיות קטן יותר מרוחב תלוש הכיסוי. חזור על שלב זה ארבע פעמים כדי להשלים "גשר" בגובה 5 תוויות.
4. קח את פיפטת P200 ושנה קצה על ידי חיתוך 1/5 מהקצה כדי להעביר את הדגימות לשקופית. יש להעביר את הדגימות למגלשה במרכז הגשר.
5. קח את הקצה של מגבון מעבדה והסר כל עודף PBST. בעזרת מלקחיים, סדרו את ה-DLMs כך שכל הדגימות פונות לצד השריר כלפי מעלה ולצד הקוטיקולה כלפי מטה.
6. באמצעות קצה פיפטה P200 סטנדרטי, יש למרוח 70 μL של מדיית הרכבה על המגלשה, תוך הימנעות מבועות אוויר. חלקו את המדיה בתבנית מעגלית בתוך החיזוקים החל מבחוץ אל המרכז.
7. הניחו החלקת כיסוי מעל החיזוקים.
8. השתמשי בלק כדי לצפות את הקצוות החיצוניים סביב היקף הכיסוי. יש למרוח בנדיבות ליצירת אטימה מלאה של הרקמה.
9. הניחו את המגלשה על משטח שטוח בחושך, תוך מתן התייבשות של 10 דקות לפחות ומניעת הלבנה או אובדן פלואורסצנטיות. כעת ניתן להשתמש בשקופיות לצורך הדמיה באופן מיידי, או לאחסן אותן באופן אחר בתיקיית שקופיות בטמפרטורה של -20°C לצפייה במועד מאוחר יותר.

איור 1: ניתוק עצבים מתקדם של סינפסות DLM במודל דרוזופילה של ALS. (A) הדור של זבובים טרנסגניים ALS המבטאים צורה מוטנטית אנושית של חלבון קושר זפת של 43 kDa (TDP-43) מוצגים בסכמה. (B) האיור מתאר את הצורה והכיוון של בית החזה אצל דרוזופילה בוגרת. באמצעות הפרוטוקול, אנו יכולים לצפות באובדן הדרגתי של שלמות סינפטית של סינפסות DLM NMJ באמצעות צביעה מבנית של נוירונים מוטוריים עם HRP (ירוק) ורקמת שריר עם פלואידין (מגנטה). המודל שלנו מתאר את אובדן השלמות הסינפטית במודל בוגר של ALS באמצעות דור של זבובים בוגרים המבטאים מוטציה מ-TDP-43M337V אנושי בתאי עצב מוטוריים (איור 1F\u2012H) בהשוואה ל-WT (איור 1C\u2012E) זבובים בסיב שריר C. חצים מדגישים דוגמאות של סינפסת WT (איור 1C) ודוגמה לאובדן שלמות סינפטית. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר בהגדלה של 63x.