חקירת פגיעה מוחית של זחל זברה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בקנה מידה גדול

תקציר

מקור: Kuipers, J. et al., מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בקנה מידה גדול (Nanotomy) של מוח בריא ופצוע של דגי זברה.J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים שיטה לחקור פגיעה מוחית של זחלי זברה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים להעברת שידור בקנה מידה גדול (STEM), טכניקה המשלבת אלמנטים של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) כדי להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בהכנת דגימות וברכישת תמונות STEM ברזולוציה גבוהה לזיהוי פגיעה מוחית.

פרוטוקול

1. הכנת דוגמאות

1. קיבוע והטבעה
   1. קיבוע
      1. הרדימו זחלי דגים בטריקאין (0.003%) שנוספו ל-E3 (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl₂, 0.33 mM MgSO_4, 10 mM HEPES, pH 7.6) מים של דגי זברה ובדקו את עומק ההרדמה על-ידי חיטוט עדין עם קצה פיפטה של 200 μl תחת מיקרוסקופ דיסקציה עד שלא זוהתה עוד תנועה (איור 1A).
      2. בעת עיבוד דגימות עבור מיקרוסקופ אלקטרונים קורלטיבי (EM) לאחר קבלת נתוני הדמיה in vivo באמצעות דימות קונפוקלי או 2 פוטונים באגרוז 1.8% כמתואר, לתקן זחלים באגרוז באמצעות 4% paraformaldehyde (PFA) במי מלח חוצצים פוספט (PBS) המכיל Triton-X-100 (0.05%).
      3. לחתוך זחלים מ agarose ותהליך עבור EM בקנה מידה גדול.
      4. תקן זחלים בפרפורמלדהיד טרי 4% ב- PBS המכיל Triton-X-100 (0.05%) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר בצינורות פלסטיק.
         הערה: תאים הגדלים בתרבית (במבחנה) יכולים להיות קבועים ישירות בגלוטראלדהיד, כמתואר בשלב הבא (1.1.1.5).
      5. הסר את התמיסה והוסף 100 μl 0.5% PFA, 2% גלוטראלדהיד (GA), ו 0.1 M נתרן cacodylate (pH 7.4). יש לאחסן למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C. יש לשטוף את הדגימות פעמיים ב-0.1 M נתרן קקודילט.
      6. חתכו את ראשי הזחלים באופן רוסטרלי למוח האחורי כדי להקל על חדירת אוסמיום. השתמשו במזרקים/מלקחיים עדינים.
      7. זחלי Postfix ב-1% אוסמיום טטרוקסיד (OsO₄)/1.5% אשלגן פרוציאניד (K₄[Fe(CN)₆]) ב-0.1 M נתרן קקודיל על קרח למשך שעתיים ושטפו 3 x 5 דקות ב-H₂O מזוקק כפול.
      8. יש לייבש אתנול ב-20 דקות דגירה בהעלאת ריכוזי האתנול (50%, 70%, 3 כפול 100%).
   2. הטבעה
      1. הכינו שרף אפוקסי על פי מתכונים סטנדרטיים המשמשים במעבדות EM.
         הערה: אנו משתמשים בשרף אפוקסי באופן הבא: מערבבים 19.8 גרם גליסיד אתר 100, 9.6 גרם 2-דודצנילסוקציניק חומצה אנהידריד, ו -11.4 גרם אנהידריד מתילנאדי באמצעות מערבל מגנטי. מוסיפים 0.5 גרם DMP-30 (טריס-(דימתילאמינומתיל) פנול) ומערבבים שוב.
      2. לדגור על הזחלים למשך הלילה ב-50% שרף אפוקסי באתנול (v/v) תוך כדי סיבוב (RT).
      3. החלף אפוקסי-שרף מדולל בשרף טהור. דוגרים במשך 30 דקות, מוסיפים שוב שרף טרי ודגרים עוד 30 דקות. שוב, רענן את השרף ולאחר מכן לדגור 3 שעות ב RT, ואחריו 15 דקות ב 58 ° C ועוד 1 שעה ב RT בלחץ נמוך (200 mbar).
      4. כיוון הראשים בתבניות סיליקון שטוחות זמינות מסחרית תחת מיקרוסקופ דיסקציה באמצעות מחט או קיסם כאשר החלק הקדמי פונה לצד התבנית או לפי הצורך (איור 1B).
      5. פולימריזציה של שרף אפוקסי למשך הלילה ב-58°C. אם שרף האפוקסי עדיין רך מדי, אפשרו ליום נוסף להתפלמר ולהתקשות בטמפרטורה של 58°C. בדקו את הנוקשות על ידי הפעלת לחץ באמצעות מלקחיים. אם זה משאיר בקלות שקע, לאפשר יום נוסף להתפלמר ולהתקשות ב 58 מעלות צלזיוס. כאשר הדגימה מוקשחת במלואה, המשך לחיתוך וחתך.
      6. חתכו את עודפי השרף מהסתום באמצעות סכיני גילוח (איור 1B).
2. חיתוך, ניגודיות והרכבה
   1. חלוקה למקטעים
      1. חתך בלוק שרף אפוקסי באמצעות אולטרה מיקרוטום.
      2. השתמשו בסכין זכוכית או בהיסטוסכין יהלום כדי לחתוך חלקים דקים למחצה (500 ננומטר) עבור צביעת טולוידין כחול/פוקסין בסיסי (איור 1D) כדי לזהות את המיקום הנכון.
      3. העבירו מקטעים דקים למחצה על שקופיות מיקרוסקופיות על ידי הרמתם עם צינור פסטר זכוכית שקצהו נסגר על ידי התכה בלהבה. מייבשים על פלטה חמה עד שלא נשארים מים. יש לצבוע במשך 10 שניות עם 1% טולוידין כחול במים על פלטה חמה, ולאחר שטיפה במים, לכתם למשך 10 שניות עם 0.05% פוקסין בסיסי בנתרן טטרבוראט 1%. בדוק עם מיקרוסקופ אור רגיל ב 10X עד 40X.
      4. כאשר מגיעים לאתר/כיוון הנכון במוח, המשיכו לחתוך את גוש שרף האפוקסי עם סכין יהלום כדי לחתוך חלקים דקים במיוחד (~ 70 ננומטר; איור 1E)
      5. השתמשו במבנים אנטומיים קלים לזיהוי במוח ובסביבתו, כולל בורות ריח, עיניים וגבולות חומר אפור-לבן, כדי לזהות את האזור המעניין במהלך חתך דק במיוחד ולהתאים את זווית החתך כאשר הדגימה מוטה.
      6. הרכיבו את המקטע על חריץ יחיד L2 x 1 רשתות נחושת (איור 1F), כדי לאפשר רכישה ללא הפרעה על-ידי פסי רשת. השתמש ברשתות מצופות Formvar כדי לתמוך במקטעים.
   2. מנוגדים
      1. מכתימים חלקים דקים במיוחד על רשתות למשך 2 דקות ב-2% אורניל אצטט במתנול ואחריו ריינולדס עופרת ציטראט למשך 2 דקות נוספות.

2. רכישת תמונות

1. מיקרוסקופ אלקטרונים להעברת שידור בקנה מידה גדול (STEM)
   הערה: אנו משתמשים בסריקת EM עם מחולל סריקה חיצוני המסוגל לרכוש שדות ראייה גדולים מרובים ברזולוציה גבוהה באמצעות זיהוי STEM. בדרך כלל, תמונה אחת שנוצרת בדרך זו שקולה לשדות הראייה של ~ 100 תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM), מה שמפחית באופן משמעותי את כמות התפרים.
   1. דגימת הרכבה במיקרוסקופ
      1. מקם רשת עם מקטע במחזיק דגימת הרשת המרובה והעבר לתא של SEM.
   2. יישור גלאי STEM
      1. שים את הרשת עם הדגימה מתחת לקרן והזז אותה למעלה כך שתהיה במרחק של כ-5 מ"מ ממוט העדשה. קבל תמונה ב 20 kV באמצעות גלאי בתוך העדשה.
      2. התמקד בקצה הרשת וכוונן את מרחק העבודה ל- 4.0 מ"מ.
      3. העבר את מחזיק הדגימה למקום בטוח והכנס את גלאי STEM.
      4. מרכז את החור של גלאי STEM בשדה התמונה על ידי סיבוב ברגי הכוונון בזמן הדמיה במהירות מרבית עם הגלאי בתוך העדשה.
      5. החזירו בזהירות את מחזיק הדגימה שיתאים בדיוק בין מוט העדשה לגלאי.
      6. רכוש תמונה עם הגלאי בתוך העדשה כדי לוודא שהיא נמצאת באזור המקטע.
      7. עבור לזיהוי STEM (השגת מדיום וכל הרבעים מוגדרים על 'מינוס'), קבל תמונה ובחר את האזור לסריקה.
      8. העלה את מתח התאוצה ל 21 kV והמתן לייצוב הקרן (תמונה יציבה שוב), ולאחר מכן עבור ל 29 kV בצעדים של 2 kV.
   3. רכישת תמונות
      1. הקרינו מראש את הדגימה (כדי למנוע שינויי בהירות הנגרמים על-ידי הקרן האלקטרונית) באמצעות הקטנת התצוגה כך שהאזור המלא לסריקה יתאים לחלון התמונה.
      2. שנה את הצמצם ל -120 מיקרומטר (כדי לשמור על הטווח הדינמי הנכון, יש להקטין את רווחי הגלאי בצעד אחד).
      3. בטל את המיקוד כדי שהתמונה תהיה מטושטשת.
      4. הפוך את האזור הסרוק להדוק ככל האפשר באמצעות האפשרות סריקת שטח מצומצם.
      5. הגדר מהירות סריקה כך שמסגרת תיסרק בערך 1 - 2 שניות.
         הערה: בהתאם לגודל ולרקמה, פעולה זו נמשכת בדרך כלל 1/2 שעה (שדה ראייה של 100 x 100 מיקרומטר (FOV)) עד 3 שעות (1,000 x 500 מיקרומטר).
      6. התקרב ל- 100X לפחות וסרוק שטח קטן למשך 10 שניות.
         הערה: כאשר אזור זה אינו משנה בהירות בהשוואה לסביבתו, די בקרינה מוקדמת.
      7. החזירו את מפתח הצמצם של 30 מיקרומטר (ואת רווח ה-STEM במדיום)
      8. התמקדו במדגם.
      9. יישר את הצמצם באמצעות המתנדנד (בהגדלה ~ 40,000X).
      10. כאשר אתה ממוקד, בחר את האזור/התכונה הבהירים ביותר והגדר את מהירות הסריקה כך שהפרטים יהיו גלויים.
      11. בתוכנת המיקרוסקופ, התאם את הבהירות והניגודיות על ידי צפייה קפדנית בהיסטוגרמה כדי לשמור על כל הפיקסלים בטווח הדינמי. בצע את אותו הדבר עבור האזור/התכונות החשוכים ביותר.
      12. חזור לאזור המואר ובדוק שוב. להיות בצד הבטוח כך שיהיה קצת מקום משני צידי ההיסטוגרמה.
      13. הקטן את התצוגה כך שהאזור המלא לסריקה יתאים לחלון ההדמיה והתחל את תוכנית רכישת השטח הגדול.
      14. השתמש באפשרות האשף כדי להגדיר פסיפס על-ידי בחירת אזור מהמסך. השתמש בגודל פיקסל 2 - 5 ננומטר, בהתאם לפרטים הדרושים. השתמש בזמן שהייה של 3 μs עבור STEM.
      15. בחר באפשרות "מיקוד אוטומטי באריח הקודם", השתמש במיקוד אוטומטי של תוכנת רכישה בקנה מידה גדול עם הגדרות ברירת המחדל של החברה, סמן את התיבה "אמת הגדרה לפני ביצוע" והגדר היכן לשמור את הנתונים.
      16. לחץ על "אופטימיזציה" כדי לבדוק את הגדרות המיקרוסקופ.
          הערה: עכשיו, הזמן הדרוש יוצג. זה עשוי להיות עד 72 שעות עבור 1 x 0.5 מ"מ אזורים.
      17. בחלון, "רזולוציית אריח מרבית" הקלד 20,000 כך שאריחים בודדים לא יהיו גדולים מ- 20k x 20k, מה שימנע אפקטים של קצוות קהים. לחץ על "ביצוע".
      18. כאשר תתבקש לבדוק מיקוד ובהירות/ניגודיות (B/C), כבה את מחולל הסריקה החיצוני וכוונן בזהירות את המיקוד והאסטיגמציה בתוכנת המיקרוסקופ. אל תשנה B/C.
          הערה: ניתן להזיז את הבמה ולשנות את ההגדלה, אך יש להחזיר את ההגדלה לגודל הפיקסלים הרצוי.
      19. הפעל שוב את מחולל הסריקה החיצוני ולחץ על "המשך".

תוצאות

איור 1: זרימת עבודה של מיקרוסקופ אלקטרונים בקנה מידה גדול של רקמות על מוחות של דגי זברה. (א)זחל זברה בן 7 ימים. (B) ראשי זחלים של דגי זברה המשובצים זה לצד זה בשרף אפוקסי. (ג) סכין זכוכית לחתך דק למחצה וכיוון הדגימה. (D) קטע מוכתם בצבע כחול טולוידין חצי דק המציג שני זחלי זברה משובצים זה לצד זה. (E) סכין יהלום לחיתוך חתכים דקים במיוחד...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כימיקלים
נקודת התכה נמוכה agarose	VWR	444152ז
טריקאין	סיגמא	E10521
טריטון- X-100	סיגמא	X100
גלוטראלדהיד	מדעי הפולי	1909
נתרן קקודילט	סיגמא	C0250
osmiumtetroxide	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	19114
אשלגןפרוציאניד (K4[Fe(CN)]6)	מרק	4984
אתנול	VWR	20821.365
אורניל אצטט	מרק	8473
נתרן-טטרבוראט	מרק	1063808
כחול Tolduidene	מרק	1273
פוקסין בסיסי	ב.ד.ה	340324
עופרת ציטראט	ב.ד.ה	הופסק
EPON
2-דודצנילסוקציניקחומצה אנהידריד	סרווה	20755
מתילנדיק אנהידריד	סרווה	29452
אתר גליצידים 100	סרווה	21045
DMP-30	מדעי הפולי	553
תבנית הטבעה שטוחה סטנדרטית	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	70901
סכין יהלום	Diatome Inc.
רשתות נחושת	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים
סרט פחמן דו-צדדי	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים
סריקת EM Zeiss Supra55	זיס
אולטרהמיקרוטום Leica EM UC7	לייקה
מחולל סריקה חיצוני של Atlas	פיביקה

. .