התמיינות והבשלה של תאי גזע עובריים אנושיים לאורגנואידים עצביים

תקציר

מקור: Cosset, E., et al. אורגנואידים עצביים אנושיים לחקר סרטן המוח ומחלות נוירודגנרטיביות. J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה מודגם פרוטוקול מדורג של תאי גזע עובריים אנושיים לאורגנואידים עצביים. השיטה כוללת גרימת היווצרות רוזטה עצבית, ואחריה הבשלה מבוקרת וטיפוח סופי על קרום הידרופובי כדי להשיג אורגנואידים עצביים מפותחים במלואם.

פרוטוקול

1. תחזוקה ותרבית של תאי גזע עובריים אנושיים לא ממוינים (hESCs)

1. בצע תחזוקה והרחבה של hSECs בתנאים נטולי מזין על ידי ציפוי מראש של צלחות במטריצה חוץ-תאית ספציפית.
   1. הפשירו 300 μL של מטריצה חוץ-תאית ב-4°C (ריכוז טווח אופייני 18-22 מ"ג/מ"ל, שמרו על קרח) וערבבו בעדינות עם 15 מ"ל DMEM קר (Dulbecco's Modified Eagle Medium) בינוני כדי למנוע ג'לציה מוקדמת מדי של המטריצה החוץ תאית. הוסף 7.5 מ"ל של המטריצה החוץ תאית לשני צלוחיות T150.
   2. דוגרים על הכלים המצופים במטריצה חוץ-תאית בטמפרטורה של 37°C למשך שעה לפחות (מקסימום לילה).
   3. הסר את תאי הגזע העובריים הבינוניים והזרעים לצפיפות של 6.5 x 104 תאים/ס"מ².
2. שמור על H1 (קו תאי ESC) בתאי גזע עובריים (HESC) בינוניים ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין.
3. מעבירים את התאים בהליך אנזימטי: מוסיפים 7.5 מ"ל של תמיסה אנזימטית לבקבוק T75 סמ"ר במשך תקופה של 1-2 דקות ב-37°C. ברגע שהתאים מנותקים לחלוטין, הוסף 7.5 מ"ל של DMEM-F12 ואז צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 300 x גרם. כדי לאפשר הישרדות טובה יותר, לוחצים מחדש תאים בצפיפות הרצויה על צלחות מצופות מטריצה חוץ-תאיות, באותו תווך המכיל מעכב חלבון קינאז הקשור ל-Rho (ROCK) (10 מיקרומטר) למשך 24 שעות.

2. אורגנואידים עצביים שמקורם ב-hESC

1. 24 שעות לפני תחילת התרבית התלת-ממדית, החליפו את מדיום תאי הגזע העובריים (HESC) בתווך נטול סרום בתוספת מעכב ROCK בגודל 10 מיקרומטר (שני המרכיבים נחוצים לתמיכה בהישרדות התא ובהיווצרות נוירוספרה ספונטנית במהלך שלב הצבירה בצלחת מיקרווול). התאים צריכים להיות במפגש של 60%. למחרת (יום 0), יש לנתק מושבות תאי גזע עובריים עובריים כתאים בודדים: להסיר את המדיום, לשטוף עם PBS ללא Ca²⁺/Mg²⁺, להוסיף 5 מ"ל של תמיסה אנזימטית, ולדגור ב 37 ° C במשך 1-2 דקות.
2. לאסוף את התאים בתווך ללא סרום בתוספת 10 מיקרומטר של מעכב ROCK ולצנטריפוגה אותם ב 300 x גרם במשך 5 דקות. להסיר את supernatant ולספור את התאים ב 10 מ"ל של תווך ללא סרום בתוספת 10 מיקרומטר של מעכב רוק.
3. במקביל, לשטוף את צלחת microwell עם 2 מ"ל של מדיום ללא סרום לכל באר צנטריפוגה צלחת ב 1200 x גרם במשך 5 דקות כדי להסיר את כל הבועות, אשר יכול למנוע היווצרות נוירוספרה.
4. הכן 28.2 x 10⁶ של תאים ב 12.5 מ"ל של מדיום ללא סרום בתוספת 10 μM מעכב רוק. מוציאים 1000 תאים/מיקרווול. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ומניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 ° C למשך הלילה (מקסימום 36 שעות). לדוגמה, כדי להשיג 30 אורגנואידים עצביים אנושיים, השתמש בבקבוק T150 אחד ב-70%-80% מהמפגש (כ-30 מיליון תאים).
5. למחרת (יום 1), אספו את הכדורים (עם P1000) והניחו אותם בצלחת 6 בארות. בכל באר, יש להוסיף 2 מ"ל של B27 בינוני ו-DMEM-F12 GlutaMAX ו-Neurobasal בינוני (לערבב ביחס של 1:1), בתוספת תוספי B27 ו-1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA). כדי לקדם אינדוקציה עצבית מהירה, השלימו את המדיום עם קוקטייל מעכב כפול SMAD (Sma ו-Mad Related Protein) המורכב מ-10 μM TGFβ (Transforming Growth Factor-beta)/Activin/Nodal inhibitor ו-0.5 μM bone morphogenic protein (BMP). מצעד זה והלאה, הכדורים מתורבתים בסיבוב (60 סל"ד, שייקר מסלולי). הסיבוב הוא קריטי כדי למנוע מהכדורים להידבק זה לזה או לצלחת.
6. החליפו את המדיום כל 2-3 ימים: כופפו את הצלחת ותנו לכדורים ליפול למטה במשך 5 דקות, הסירו מחצית מהמדיום (2 מ"ל), והוסיפו 2 מ"ל של מדיום B27 טרי בתוספת גורמי גדילה ומעכבים. אין לצנטריפוץ את הספירות.
7. ביצוע אינדוקציה עצבית בהתאם למסלול הזמן הבא:
   1. מימים 1-4, תרבית את הספירות בתווך B27 בתוספת SMAD כפול. קוקטייל עיכוב SMAD כפול (10 μM TGFβ/Activin/Nodal inhibitor ו-0.5 μM BMP inhibitor) מקדם אינדוקציה עצבית.
   2. בימים 4-11, לקדם התפשטות של רוזטות עצביות שמקורן hESC (לתוך הספירות), על ידי הוספת 10 ng/mL גורם גדילה אפידרמיס (EGF) ו 10 ng/mL גורם פיברובלסט בסיסי (bFGF) למדיום B27 בתוספת קוקטייל SMAD כפול.
      הערה: ביום ה-11, רוב התאים אמורים להיות חיוביים לנסטין.
   3. מימים 11-13, תרבית את הכדורים בתווך B27 בתוספת מעכב BMP 0.5 מיקרומטר.
   4. בין הימים 13-21, תרבית את הספירות בתווך B27 בתוספת 10 ng/mL גליה נגזר גורם נוירוטרופי (GDNF), 10 ng/mL המוח נגזר גורם נוירוטרופי (BDNF) ו 1 מיקרומטר של מעכב γ-secretase. GDNF ו- BDNF מקדמים התמיינות עצבית וגלייה. מעכב γ-secretase מאפשר התבגרות עצבית גדולה יותר.
   5. ביום ה-21 מניחים את הכדורים (כ-1,000 כדורים) על קרום פוליטטרה-פלואוראתילן הידרופילי (PTFE) (קוטר 6 מ"מ, 0.4 מיקרומטר) שהונח על לוח תרבית המיועד ל-6 לוחות באר. עצור כל סיבוב משלב זה. נוכחותן של רוזטות, שנצפתה במיקרוסקופ שדה בהיר, מצביעה על התחלת התמיינות עצבית. ניתן לצפות ברוזטות העצביות 2-3 ימים לאחר ציפוי כדורים על קרום PTFE.
   6. הוסף 1 מ"ל של מדיום B27 בתוספת גורמי גדילה ומעכבי גדילה (כדלקמן) לכל באר מתחת לתוספת הממברנה, כל 2-3 ימים (בדרך כלל בימים שני, רביעי ושישי), במשך 3 שבועות הבאים של בידול.
   7. בימים 21-25, טפחו אורגנואידים עצביים אנושיים באותו מדיום התבגרות עצבית.
   8. מימים 25-28, רק להשלים B27 בינוני עם 1 μM γ-secretase inhibitor.
   9. בימים 28-39, יש להפסיק להוסיף את מעכב γ-secretase ולהמשיך בתרבית אורגנואידים עצבית אנושית בתווך B27 בלבד.
      הערה: לאחר 3 שבועות, אורגנואידים עצביים מוכנים לשימוש להשתלת GIC. לאורך ההתבגרות העצבית, נצפתה ירידה של סמן עצבי לא בוגר נסטין ועלייה של סמנים עצביים בוגרים β3-tubulin ו- GFAP.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת 6 בארות (צלחת 6 בארות)	פלקון / קורנינג	07-201-588
אגרוול 400 (צלחות תרבית מיקרווול)	טכנולוגיות StemCell	34421
תוספי B27 (B27)	לייף טכנולוגיות / Invitrogen	1238	עבור שני הפרוטוקולים, פתרון מלאי 100x, פתרון סופי 1x
גורם נוירוטרופי מוחי (BDNF)	הנחיית תאים	GFH1-2	עבור שני הפרוטוקולים, תמיסת מלאי 100 מיקרוגרם/מ"ל ב-H2O טהור, תמיסה סופית 20 ננוגרם/מ"ל
Compound E a γ–secretase inhibitor (מעכב γ–secretase)	קלביוכם	CAS 209986-17-4	עבור שני הפרוטוקולים (מעכב גמא-secretase XXI), תמיסת מלאי 5 mM ב- DMSO, פתרון סופי 1 מיקרומטר
דימתיל סולפוקסיד טהור (DMSO)	סיגמא-אולדריץ'	C6164	תרכובות ממסות, מוכנות לשימוש
מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM)	לייף טכנולוגיות	12491-015	עבור תרבית תאים, מוכן לשימוש
תערובת בינונית עיט שונה של דולבקו F-12 (DMEM-F12)	גיבקו	11320033	עבור תרבית תאים, מוכן לשימוש
EDTA 0.1 מילימ"ר (EDTA)	לייף טכנולוגיות	AM9912	עבור תרבית תאים, מוכן לשימוש
גורם נוירוטרופי שמקורו בתאי גליה (GDNF)	הנחיית תאים	GFH2-2	עבור שני הפרוטוקולים, תמיסת מלאי 100 מיקרוגרם/מ"ל ב-H2O טהור, תמיסה סופית 20 ננוגרם/מ"ל
קרום פוליטטרה-פלואוראתילן הידרופילי (קרום PTFE)	ממשק BioCell	הופסק
LDN-193189 (מעכב BMP)	Axon Medchem /Stemgen	04-0072-02 /1509	Dual/Smad, פתרון מלאי 5 מ"מ ב-DMSO, פתרון סופי 0.5 מיקרומטר
ל-גלוטמין (ל-גלוטמין)	גיבקו	25030081	L-גלוטמין (200 מילימול), תמיסת מלאי 200 מילימול, תמיסה סופית 2 מ"מ
מטריג'ל (מטריצה חוץ-תאית)	BD Biosciences	354277	מטריצה בעלת הסמכת hESC, תמיסת מלאי 18-22 מ"ג/מ"ל, תמיסה סופית 180-220 מיקרוגרם/מ"ל
הוספת צלחת תרבית מיליצל-CM (0.4 מיקרומטר) (הוספת צלחת תרבית)	מיליפור	PICM03050
נוגדן חד שבטי נגד β-טובולין III	סיגמא	T8660	דילול 1/1000
MS Orbital Shaker, MS-NOR-30 (שייקר מסלולי)	מדע עיקרי	MS-NRC-30
נוירובזל (נוירובזל)	לייף טכנולוגיות / Gibco	21103049	תחזוקה והבשלה אוכלוסיות תאים עצביים עובריים , מוכן לשימוש
חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA)	גיבקו	11140	חומצות אמינו לא חיוניות 100X, תמיסת מלאי 100x, תמיסה סופית 1x
נוגדן Nurr1 (M-196)	סנטה קרוז	SC-5568	דילול 1/100
Nutristem (hESC בינוני)	תעשיות ביולוגיות	05-100-1א	מדיה של תאי גזע, מוכנה לשימוש
פניצילין / סטרפטומיצין (פניצילין / סטרפטומיצין )	לייף טכנולוגיות / Gibco	15140122	עבור תרבית תאים, תמיסת מלאי 5 מ"ג/מ"ל, תמיסה סופית 50 מיקרוגרם/מ"ל
פוספט מלח חוצץ ללא Ca2+/Mg2+ (PBS ללא Ca2+/Mg2+)	לייף טכנולוגיות	14190250	עבור תרבית תאים, מוכן לשימוש
קינאז הקשור לרו Y-27632 (ROCK)	Abcam ביוכימיקלים	ab120129-1	מעכב סלעים, תמיסת מלאי 50 מילימטר ב-DMSO, תמיסה סופית 10 מיקרומטר
SB-431542 (מעכב TGFβ/Activin/Nodal)	עלייה	ASC- 163	Dual-Smad, פתרון מלאי 50 מ"מ ב-DMSO, פתרון סופי 10 מיקרומטר
StemPro Accutase (תמיסה אנזימטית hESC)	גיבקו	A11105-01	פתרון אנזימטי hESC, מוכן לשימוש
בקבוק T150 (צלוחיות T150)	בז	08-772-1F
שינוי גורמי גדילה בטא 3 (TGFβ3)	הנחיית תאים	GFH109-2	עבור פרוטוקול דופמינרגי, תמיסת מלאי 100 מיקרוגרם/מ"ל באתנול טהור, תמיסה סופית 1 נ"ג/מ"ל
טריפסין 0.25% (תמיסה אנזימטית)	לייף טכנולוגיות	15050065	פתרון אנזימטי, מוכן לשימוש
X-vivo (מדיום ללא סרום)	לונזה	BE04-743Q	מדיום ללא סרום, מוכן עבורך