יצירת אורגנואידים עצביים דופמינרגיים מתאי גזע עובריים אנושיים

תקציר

מקור: Cosset, E. et al. אורגנואידים עצביים אנושיים לחקר סרטן המוח ומחלות נוירודגנרטיביות. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את ההתמיינות של תאי גזע עובריים אנושיים (תאי גזע עובריים) לנוירונים דופמינרגיים, כדי לספק מודל לחקר מחלת פרקינסון. תאי גזע עובריים בתרבית בתווך אינדוקציה עצבי בצלחת מיקרו-באר כדי ליצור נוירוספרות תלת-ממדיות. לאחר מכן הם מתורבתים במדיום אינדוקציה עצבי כדי לקדם את ההתמיינות לנוירוני אב דופמינרגיים. ההבשלה הסופית של תאי העצב מתרחשת בהחדרת תרבית בתנאי ממשק אוויר-נוזל, וכתוצאה מכך אורגנואידים תלת-ממדיים המורכבים מנוירונים דופמינרגיים בוגרים.

פרוטוקול

1. אורגנואידים דופמינרגיים שמקורם ב-hESC למחקרי מחלת פרקינסון (PD)

1. יום 0: הגבירו תאי גזע עובריים עובריים עובריים בתרבית דו-ממדית עד למפגש של 60% (יום 0), ולאחר מכן החליפו את מדיית תאי הגזע המשמשת לשמירה על תכונות פלוריפוטנטיות של תאי גזע עובריים עובריים (HESC) בתווך נטול סרום. התחל אינדוקציה עצבית על ידי תוספת מדיום תרבית עם מעכב חלבון מורפוגנטי עצם (BMP) 0.5 מיקרומטר ומעכב 10 מיקרומטר גורם גדילה מתמיר בטא (TGFβ)/Activin/Nodal (קוקטייל עיכוב SMAD כפול), ולאחר מכן הוסף 10 μM מעכב חלבון קינאז הקשור ל- Rho (ROCK) למשך 24 שעות כדי להגדיל את שיעור ההישרדות של תאים במהלך המעבר.
2. יום 1: הכינו את צלחת המיקרווול עם 2.5 מ"ל לכל באר של מדיום ללא סרום בתוספת מעכב BMP 0.5 מיקרומטר, מעכב TGFβ/Activin/Nodal 10 מיקרומטר ומעכב ROCK 10 μM. כדי לציין תאים לכיוון תבנית הגחון של הצינור העצבי, הוסף קיפוד קולי 100 ng/mL (SHH), 100 ng/mL פיברובלסט גורם גדילה 8 (FGF8), ואגוניסט מוחלק 2 μM. צנטריפוגה את הצלחת (רק עם בינוני וללא תאים) ב 1200 x גרם במשך 5 דקות כדי להסיר בועות אוויר מן microwells.
   1. לאחר יום אחד של אינדוקציה עצבית בדו-ממד, הסר את המדיום ושטוף במהירות במי מלח חוצצי פוספט (PBS) ללא Ca²⁺/MgCl²⁺. לנתק את המושבות בתרחיף של תאים בודדים על ידי הוספת 7.5 מ"ל של תמיסה אנזימטית רקומביננטית בצלוחית^T75 ס"מ 2. יש לדגור במשך 2 דקות בטמפרטורה של 37°C ולאחר מכן להשלים עם 7.5 מ"ל של תערובת הנשר הבינוני/מזין F-12 (DMEM-F12) של Dulbecco.
   2. אסוף את מתלה התא והצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant ולספור את התאים באותו מדיום המשמש להכנת צלחת microwell.
   3. התאם את הנפח הבינוני כדי לקבל תרחיף תאים המאפשר ליצור נוירוספרות המכילות 1000 תאים לכל מיקרו-באר (לדוגמה, צלחת המיקרו-באר המשמשת כאן מכילה 4,700 מיקרו-בארות לכל באר). אז, להכין 4.7 מיליון תאים ב 2.5 מ"ל של בינוני ולהוסיף אותו הקודם 2.5 מ"ל של בינוני כבר ממוקם בצלחת.
   4. כדי לפזר נכון את התאים בכל מיקרווול, נערו בעדינות את הצלחת וצנטריפוגו את צלחת המיקרווול 300 x גרם למשך 5 דקות. דגרו על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות כדי ליצור כדורים.
3. יום 2: שוטפים בעדינות את המיקרו-בארות עם המדיום ואוספים ואז מעבירים את הכדורים בצלחת שש בארות מטופלת ברקמות. החלף את המדיום במדיום נוירובזאלי בתוספת 1% B27, 1x חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 2 מילימטר L-גלוטמין ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. בנוסף, הוסף גורמי אזוריזציה SHH, FGF8, אגוניסט מוחלק, ומולקולות קטנות מעכבות SMAD כפולות.
   1. מניחים את הכדורים בסיבוב ב-37°C (60 סל"ד, שייקר מסלולי) ומשנים חצי בינוני טרי בתוספת כל 2-3 ימים.
4. יום 3: כדי לשפר את האינדוקציה העצבית ולהפוך לאבות עצביים עם זהות של המוח האמצעי, השלימו את המדיום עם מעכב בטא 3 מיקרוגן סינתאז קינאז-3 בטא (GSK-3β), אשר מפעיל את מסלול Wnt/β-catenin. שמור על מעכב GSK-3β בתווך עד היום 13. פיצול לשתי צלחות 6 בארות חדשות המטופלות ברקמה כדי להפחית את צפיפות הכדור לכל באר ולמנוע צבירת כדורים.
   הערה: ביום 8, רוב התאים צריכים להיות חיוביים עבור נסטין.
5. יום 8: התחל את ההתבגרות העצבית: החלף את גורמי האזוריות SHH, FGF8, אגוניסט מוחלק וקוקטייל עיכוב SMAD כפול ב- 0.5 mM dibutyryl cyclic adenosine monophosphate (cAMP) (לטובת התבגרות), 20 nM מעכב של היסטון deacetylase (ליציאה ממחזור התא), 1 μM γ-secretase מעכב וגורמי גדילה, 10 ng/mL גורם נוירוטרופי נגזר קו תאי גליה (GDNF), 10 ננוגרם/מ"ל גורם נוירוטרופי מוחי (BDNF), 1 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה טרנספורמטיבי β3 (TGFβ3), ו-5 נ"ג/מ"ל גורם גדילה פיברובלסט 20 (FGF20) (שניהם לטובת הישרדות אב דופמינרגי [DA]). שנה את המדיום כל 2-3 ימים.
6. יום 21: יצירת האורגנואיד העצבי: זרע סביב 100 נוירוספרות בתנאי ממשק אוויר-נוזל על פוליטטרה-פלואוראתילן (קרום PTFE, קוטר 6 מ"מ). מעבירים את הממברנה לתוספת לוחית תרבית (0.4 מ"מ) ומוסיפים 1.2 מ"ל של מדיום הבשלה עצבית המשמש להתמיינות נוירוספרית כפי שתואר קודם לכן.
   1. עצור כל סיבוב משלב זה. שנה את המדיום כל 2-3 ימים עד להשגת נקודת זמן הבידול הנדרשת.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת 6 בארות (צלחת 6 בארות)	פלקון / קורנינג	07-201-588
אגרוול 400 (צלחות תרבית מיקרווול)	טכנולוגיות StemCell	34421
תוספי B27 (B27)	לייף טכנולוגיות / Invitrogen	1238	עבור שני הפרוטוקולים, פתרון מלאי 100x, פתרון סופי 1x
גורם נוירוטרופי מוחי (BDNF)	הנחיית תאים	GFH1-2	עבור שני הפרוטוקולים, תמיסת מלאי 100 מיקרוגרם/מ"ל ב-H2O טהור, תמיסה סופית 20 ננוגרם/מ"ל
CHIR-99021 (מעכב GSK-3β)	אקסון מדכם	CT99021	עבור פרוטוקול דופמינרגי, תמיסת מלאי 7.5 מילימטר ב-DMSO, פתרון סופי 3 מיקרומטר
Compound E a γ–secretase inhibitor (מעכב γ–secretase)	קלביוכם	CAS 209986-17-4	עבור שני הפרוטוקולים (מעכב גמא-secretase XXI), תמיסת מלאי 5 מילימטר ב-DMSO, תמיסה סופית 1 מיקרומטר
Dibutyryl cyclic-AMP (Dibutyryl cAMP)	סיגמא	D0627	עבור פרוטוקול דופמינרגי, פתרון מלאי 0.5 M ב- DMSO, פתרון סופי 0.5 mM
תערובת בינונית עיט שונה של דולבקו F-12 (DMEM-F12)	גיבקו	11320033	עבור תרבית תאים, מוכן לשימוש
EDTA 0.1 מילימ"ר (EDTA)	לייף טכנולוגיות	AM9912	עבור תרבית תאים, מוכן לשימוש
גורם גדילה פיברובלסט 20 (FGF20)	פפרוטק	100-41	עבור פרוטוקול דופמינרגי, תמיסת מלאי 100 מיקרוגרם/מ"ל ב-H2O טהור, תמיסה סופית 5 ננוגרם/מ"ל
גורם גדילה פיברובלסט 8 (FGF8)	פפרוטק	GFH176-5	עבור פרוטוקול דופמינרגי, תמיסת מלאי 100 מיקרוגרם/מ"ל ב-H2O טהור, תמיסה סופית 100 נ"ג/מ"ל
גורם נוירוטרופי שמקורו בתאי גליה (GDNF)	הנחיית תאים	GFH2-2	עבור שני הפרוטוקולים, תמיסת מלאי 100 מיקרוגרם/מ"ל ב-H2O טהור, תמיסה סופית 20 ננוגרם/מ"ל
קרום פוליטטרה-פלואוראתילן הידרופילי (קרום PTFE)	ממשק BioCell	הופסק
LDN-193189 (מעכב BMP)	Axon Medchem /Stemgen	04-0072-02 /1509	Dual/Smad, פתרון מלאי 5 מ"מ ב-DMSO, פתרון סופי 0.5 מיקרומטר
ל-גלוטמין (ל-גלוטמין)	גיבקו	25030081	L-גלוטמין (200 מילימול), תמיסת מלאי 200 מילימול, תמיסה סופית 2 מ"מ
הוספת צלחת תרבית מיליצל-CM (0.4 מיקרומטר) (הוספת צלחת תרבית)	מיליפור	PICM03050
MS Orbital Shaker, MS-NOR-30 (שייקר מסלולי)	מדע עיקרי	MS-NRC-30
תוספי N2 (N2)	Invitrogen	17502-048	עבור תרבית GIC, פתרון מלאי 100x, פתרון סופי 1x
נוירובזל (נוירובזל)	לייף טכנולוגיות / Gibco	21103049	תחזוקה והבשלה אוכלוסיות תאים עצביים עובריים , מוכן לשימוש
חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA)	גיבקו	11140	חומצות אמינו לא חיוניות 100X, תמיסת מלאי 100x, תמיסה סופית 1x
Nutristem (hESC בינוני)	תעשיות ביולוגיות	05-100-1א	מדיה של תאי גזע, מוכנה לשימוש
פניצילין / סטרפטומיצין (פניצילין / סטרפטומיצין )	לייף טכנולוגיות / Gibco	15140122	עבור תרבית תאים, תמיסת מלאי 5 מ"ג/מ"ל, תמיסה סופית 50 מיקרוגרם/מ"ל
פוספט מלח חוצץ ללא Ca2+/Mg2+ (PBS ללא Ca2+/ Mg2+)	לייף טכנולוגיות	14190250	עבור תרבית תאים, מוכן לשימוש
Purmorphamin (אגוניסט מוחלק)	קלביוכם	SML0868	עבור פרוטוקול דופמינרגי, תמיסת מלאי 10 mM ב- DMSO, פתרון סופי 2 מיקרומטר
קינאז הקשור לרו Y-27632 (ROCK)	Abcam ביוכימיקלים	ab120129-1	מעכב סלעים, תמיסת מלאי 50 מילימטר ב-DMSO, תמיסה סופית 10 מיקרומטר
SB-431542 (מעכב TGFβ/Activin/Nodal)	עלייה	ASC- 163	Dual-Smad, פתרון מלאי 50 מ"מ ב-DMSO, פתרון סופי 10 מיקרומטר
סוניק קיפוד (SHH)	הנחיית תאים	GFH168-5	עבור פרוטוקול דופמינרגי, תמיסת מלאי 100 מיקרוגרם/מ"ל ב-H2O טהור, תמיסה סופית 100 נ"ג/מ"ל
StemPro Accutase (תמיסה אנזימטית hESC)	גיבקו	A11105-01	פתרון אנזימטי hESC, מוכן לשימוש
בקבוק T150 (צלוחיות T150)	בז	08-772-1F
שינוי גורמי גדילה בטא 3 (TGFβ3)	הנחיית תאים	GFH109-2	עבור פרוטוקול דופמינרגי, תמיסת מלאי 100 מיקרוגרם/מ"ל באתנול טהור, תמיסה סופית 1 נ"ג/מ"ל
Trichostatine A (מעכב של deacetylase היסטון)	סיגמא	T8552	עבור פרוטוקול דופמינרגי, תמיסת מלאי 100 מיקרומטר ב- DMSO, פתרון סופי 20 ננומטר
TrypLE (תמיסה אנזימטית רקומביננטית)	Invitrogen	12604021	פתרון אנזימטי רקומביננטי, מוכן לשימוש
טריפסין 0.25% (תמיסה אנזימטית)	לייף טכנולוגיות	15050065	פתרון אנזימטי, מוכן לשימוש
X-vivo (מדיום ללא סרום)	לונזה	BE04-743Q	מדיום ללא סרום, מוכן לשימוש