יצירת מודל עכבר של פגיעה מוחית טראומטית באמצעות גשושית אימפקטור

תקציר

מקור: Furmanski, O., et al. מודל השפעה קורטיקלית מבוקרת של פגיעה מוחית בעכבר עם השתלה טיפולית של תאים עצביים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים את ההליך לגרימת פגיעה מוחית טראומטית בגולגולת פתוחה בעכבר על ידי ביצוע חתך בגולגולת קו האמצע, קידוח דרך הגולגולת והסרת דש העצם כדי לחשוף את קליפת המוח, והפעלת לחץ גבוה כדי לגרום לטראומה. לאחר מכן תופרים את הפצע כדי להכין את מודל העכבר לניסויים הבאים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. כריתת קרנייקטומיה והשפעה קורטיקלית מבוקרת

1. הכנת מכשיר ההשפעה הקורטיקלית המבוקרת וציוד כירורגי.
   1. טען מזרק 1 מ"ל קצה החלקה עם 0.5 מ"ל של מלח סטרילי להשקיית פצעים. חבר מחט 25 גרם למזרק כדי לשלוט בהשקיה.
   2. הכינו תמיסה מדוללת של ציקלוספורין A (CsA) בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל. טען מזרק שני 1 מ"ל קצה החלקה עם 0.5 מ"ל של פתרון CsA לדיכוי חיסוני. חבר מחט 25 G ומעלה למזרק CsA.
   3. חבר את בוכנת ההשפעה הקורטיקלית המבוקרת לזרוע במסגרת סטריאוטקסית והגדר אותה לזווית של 15 מעלות. חבר גשושית אימפקטור 3 מ"מ לבוכנה.
   4. הגדר את מהירות הפגיעה ל- 1.5 מטר לשנייה ואת זמן השהייה של הפגיעה ל- 0.1 שניות כדי לייצר פגיעה קלה בקליפת המוח.
2. ביצוע כריתת גולגולת חד צדדית
   1. הניחו את העכבר בתא השראת הרדמה המחובר לוופורייזר איזופלורן עם מקור חמצן דחוס. יש להשרות הרדמה עם ~3% איזופלורן ב~0.7 ליטר/דקה חמצן. בדוק את עומק ההרדמה על ידי חוסר תגובה לצביטת הבוהן.
   2. גלחו את הקרקפת באמצעות קוצץ חשמלי ונגבו כל פרווה רופפת.
   3. הניחו את העכבר במסגרת סטריאוטקסית עם חרוט אף הרדמה צמוד.
      1. הניחו משטח חימום של 37°C על המסגרת הסטריאוטקסית מתחת לעכבר כדי לשמור על טמפרטורת הגוף תחת הרדמה. מקבעים את הראש במקומו בעזרת מוטות אוזניים ומוט נשיכה וכוונו את הראש כך שהעצם הקדמית של הגולגולת תהיה אופקית. יש לשמור על הרדמה ב~1.5%-2% איזופלורן למשך כל תקופת הניתוח.
   4. כדי לבצע טיפול לפני הניתוח והכנה כירורגית אספטית, להחיל משחה אופתלמית אנטיביוטית על העיניים באמצעות צמר גפן סטרילי. יש למרוח תמיסה על בסיס יוד על אזור הקרקפת המגולח. הסירו זאת עם 70% אתנול. כסו את החיה עם וילון כירורגי fenestrated כך החלק העליון של הראש גלוי, אבל העיניים מכוסות.
   5. בצעו חתך בקו האמצע (1.5-2 ס"מ) בקרקפת בעזרת אזמל או מספריים. השתמשו במקלוני צמר גפן סטריליים כדי לנקות את הפצע ולנקות את הפאשיה שנותרה מקו האמצע בברגמה.
   6. השתמש בבדיקה המשפיעה כדי לזהות את אתר כריתת הגולגולת.
      1. הגדר את נקודת הייחוס הסטריאוטקסית (X = 0, Y = 0) לברגמה. כוונן את הגשושית לרוחב ל-2 מ"מ משמאל לקו האמצע. שרטט עיגול בקוטר 5 מ"מ סביב הבדיקה באמצעות סמן עדין בטוח כירורגית. הרם וסובב את המשפיע מחוץ למקומו.
   7. השתמש בכלי היד של ערכת המיקרו-מנוע הסיבובית במהירות גבוהה כדי ליצור חור פתוח בגולגולת באמצעות מקדח בור עגול של 0.6 מ"מ או 0.8 מ"מ במהירות מרבית ~ 70%-80%. הפעל לחץ קל על הגולגולת בעת קידוח לאורך קו המתאר ההיקפי של 5 מ"מ כדי לדלל גבול זה.
      1. אין להפעיל לחץ עודף בזמן הקידוח. רטט, דחיסה או חדירה מקרית עלולים לגרום לפגיעה בקליפת המוח. במקום זאת, אפשר למהירות המקדחה לבצע את העבודה.
      2. אין לקדוח בכל נקודה נתונה זמן רב מדי כדי למנוע חיכוך מוגזם של חימום הגולגולת. השקו את כריתת הגולגולת מדי פעם במי מלח סטריליים כדי להסיר פסולת ולהפחית את החימום מהכלי הסיבובי.
      3. שימו לב היטב בעת קידוח מעל קו התפר העטרתי מכיוון שנקודות אלה פגיעות לדימום.
   8. השתמש בזוג פינצטות עדינות כדי להסיר את דש הגולגולת כאשר מתאר הגולגולת דליל מספיק. אחזו בדש באופן מדיאלי, הרימו ומשכו בעדינות לרוחב בתנועה רדיאלית.
      1. אין לפגוע בדורה מאטר בעת הרמת הדש; הדבר עלול לגרום לפציעה חמורה ודימום.
3. ביצוע פגיעה קלה מבוקרת בקליפת המוח
   1. נקו את בדיקת המשפיע עם פד הכנה סטרילי לאלכוהול. החזירו את הגשושית המשפיעה למקומה מעל קליפת המוח החשופה. מנמיכים את הגשושית עד שהיא נוגעת במשטח הדורה מאטר. סמן מיקום זה כ- Z = 0.
   2. משוך את הבוכנה ועבור ל- Z = -1.0 מ"מ. שחרר את הבוכנה כדי להשפיע על קליפת המוח.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1 מ"ל מזרקים	בקטון דיקינסון (BD)	309659
מחטי מזרק Precision Glide 25G	בקטון דיקינסון (BD)	305122
וופורייזר הרדמה	וטלנד	0521-11-22
בד לטיפול בבעלי חיים			רכישה מחנות כלבו
בטדין	מוצרי Purdue	NDC-67618-151-32
חמצן דחוס			המוצר הנבחר; משתנה לפי אזור
ציקלוספורין A	סיגמא-אולדריץ'	30024-100 מ"ג
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	סיגמא-אולדריץ'	D8418-500 מ"ל
DMEM	Invitrogen (ThermoFisher)	A14430-01
פינצטה עדינה	כלים מדעיים משובחים	11254-20
מלקחיים	כלים מדעיים משובחים	91106-12
ערכת מיקרו-מנוע סיבובית במהירות גבוהה	Foredom אלקטריק ושות'	K.1070 - K.107018
סט בורות מיקרו מקדחה אידיאלי של 5	Cell Point סיינטיפיק	60-1000
השפעה סטריאוטקסית אחת עבור CCI	לייקה ביוסיסטמס	39463920
משחה אופתלמית	פלקון פרמצבטיקה	NDC-61314-631-36
מסגרת סטריאוטקסית קטנה של מכרסם	סטולטינג	51925
מספריים קטנים	כלים מדעיים משובחים	14060-09
רפידות הכנה סטריליות לאלכוהול	פישרברנד	06-669-62
מקלוני צמר גפן סטריליים/קנדל Q-tips	Tyco Healthcare	540500
מי מלח סטריליים	הוספירה	NDC-0409-1966-07
תפרים - 5.0 משי עם מחט מעוקלת	אואזיס	MV-682