מידול דימום הנגרם על ידי תרופות בזחלי דגי זברה

תקציר

מקור: Crilly, S., et al. שימוש בזחלי דגי זברה כדי ללמוד את ההשלכות הפתולוגיות של שבץ דימומי. J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה, עוברים מופרים של דגי זברה עוברים דה-כוריון תחת מיקרוסקופ סטריאו ולאחר מכן נחשפים למעכב סינתזת כולסטרול, מה שמוביל להתפתחות קרעים בכלי הדם ודימומים מוחיים בזחלים. זחלים דימומיים, הניתנים לזיהוי על ידי כתמים אדומים ברורים, מופרדים לאחר מכן תחת מיקרוסקופ לניתוח נוסף.

פרוטוקול

הערה: קווים טרנסגניים המשמשים במחקר זה כוללים שושלת ספציפית למקרופאגים mpeg1:mCherry (נבנה בתוך הבית), mpo ספציפי לנויטרופילים: GFP, gata1:dsRed ספציפי לאריתרואידים ו- ubiq:secAnnexinV-mVenus, כתב למוות תאים (נגזר מחדש בבית) על רקע מסוג בר, nacre (mitfa^w2/w2) ומוטאנט (bbh^m292).

1. יום 0: ייצור ואיסוף ביצים

1. לאסוף עוברים מופרים מהשרצה טבעית בתיבות רבייה המיוצרות מדגי זברה בוגרים זכר אחד ו-1-2 נקבות.
   הערה: עבור פרוטוקול atorvastatin, כל חיות בר / transgenic ניתן להשתמש; עם זאת, שיעורי הדימום שונים מעט בין הזנים.
2. יש לדגור על 100 עוברים בטמפרטורה של 28°C בתווך עובר E3 סטנדרטי לכל צלחת פטרי ולשלב בהתאם להנחיות הסטנדרטיות.
3. ב~6 שעות לאחר ההפריה (hpf), הוציאו עוברים מתים ולא מופרים מהצלחת באמצעות פיפטה של פסטר. איור 1 מראה את ציר הזמן של הניסוי.

2. יום 1: טיפול Atorvastatin ב 24 hpf

1. עוברים Dechorionate לטיפול atorvastatin באמצעות מלקחיים חדים דקים במיוחד. ניתן להתאים את המספרים הדרושים לניסויים בהתאם.
2. הוסף 30 מ"ל של עובר E3 בינוני לשתי צלחות פטרי נקיות. השתמש בצלחת אחת עבור 100 עוברים.
   הערה: אם צלחות מיועדות לתרבית תאים, דגי זברה מפורקים בשלב מוקדם זה נדבקים לעתים קרובות לתחתית. כדי להימנע מכך, שטפו היטב את הצלחות במים נקיים לפני השימוש.
3. הסר 60 μL של מים עובריים מצלחת הטיפול ולהוסיף 60 μL של 0.5 mM atorvastatin (טרקטורון). בריכוז מלאי של 0.5 mMm, הדילול הנ"ל יביא לריכוז סופי של 1 μM, וכתוצאה מכך ~20% מהזחלים שאינם דימום (ICH-) ו~80% מהזחלים מדממים (ICH+). השתמש בצלחת השנייה עבור פקדים לא מטופלים.
   הערה: Atorvastatin הוא מסיס במים מזוקקים (3 מ"ג לתוך 10 מ"ל) כדי להפוך 0.5 mM תמיסת מלאי. יש לדגור לילה בטמפרטורת החדר בחושך עם תסיסה מכיוון שהמסיסות לוקחת קצת זמן. מסיסות מלאה יכולה להימשך עד שבוע. אין להשתמש DMSO (Dimethyl sulfoxide). התמיסה מאוחסנת בטמפרטורה של -20°C. אין להקפיא-להפשיר.
4. בעזרת פיפטת פסטר מעבירים 100 עוברים בכמה שפחות מים לפלטות הטיפול.
5. לדגור על הצלחות ב 28 ° C.
   הערה: ICH (דימום תוך מוחי) יתרחש בין 33 ל 48 hpf. Atorvastatin לא צריך להיות מוסר כמו דגירה ארוכה מ 24 שעות אינו גורם לבעיות התפתחותיות נוספות.

3. יום 2: הפרדת אוכלוסיות ICH- ו- ICH+ ב- 50 HPF

1. הפרידו את דגי ICH+ מאוכלוסיות ICH והעבירו למנות חדשות בקלות.
   1. אם משתמשים במודל הטרקטורונים בריכוז של 1 מיקרומטר, 75-100% מהזחלים יציגו דימום (ICH+) בנקודת זמן זו.
      הערה: התגובה של הזחלים שונה בין הזנים, אם הזחלים אינם מדממים בתדרים הרצויים, להשתמש אצווה טרייה של atorvastatin או ריכוז גבוה יותר. אם הזחלים לא הציגו דימום על ידי 48 hpf אז לשקול אותם ICH-.
   2. אם משתמשים במודל BBH, כל המוטנטים ההומוזיגוטיים יציגו דימום של 48 hpf. אם משתמשים בקרוס הטרוזיגוטי ניתן להשתמש באחים הטרוזיגוטיים ופראיים כחיות ביקורת לניסויים.
2. במידת הצורך, מרדים את הזחלים על ידי הוספת 0.02% MS222 למדיה E3. באמצעות פיפטה פסטר, מיין את הזחלים עבור נוכחות של דם בראש לתוך מדיה E3 טרי. ראה איור 2.
   הערה: דם בראש עשוי להופיע במוח הקדמי, האמצעי או האחורי או בשילוב, ונפח הדימום יכול להשתנות בין בעלי חיים. במוטציות BBH, ICH קשור לעתים קרובות עם בצקת חמורה, אשר מזוהה על ידי ראשים גדולים יותר, רווח רחב יותר בין העיניים, ודימום מפוזר יותר. עם זאת, לא כל זחלי ICH+ bbh מציגים בצקת.

תוצאות

איור 1: גרפיקה של ציר הזמן הניסויי לאפיון פגיעות מוחיות, לוקומוטוריות ותוצאות נוירו-דלקתיות. ICH, דימום תוך מוחי; BBH, ראש בועה.

תרשים 2: ICH+ פנוטיפים של דימום מוחי. דוגמאות לפנוטיפים של ICH זחל שנשמרו על רקע מהונדס של כתב GATA1:DsRed שנצפו במיקרוסקופ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
24 צלחות באר	סיגמא-אולדריץ'	CLS3527
אינקובטור 28 מעלות צלזיוס	LMS	210
אטורבסטטין	סיגמא-אולדריץ'	PZ0001-5mg
תיבות רבייה	מערכות Thoren Aquatics	10011
חדר התצפית Daniovision	נולדוס	לא ישים
E3 בינוני 1x			4% אוקיינוס מיידי, 500 מיקרוליטר מתילן כחול ב-1 ליטר dH2O
תוכנת EthoVision XT	נולדוס	גרסה 11
אוקיינוס מיידי	אינסטנט אושן	SS15-10
מיקרוסקופ	לייקה	MZ95	מיקרוסקופ דיסקציה
פיפטה P1000	גילסון	F144059M
קצוות פיפטה P1000	סטארלאב	S1122-1830
פיפטות פסטר	סטארלאב	E1414-0300
צלחות פטרי	קורנינג	101VR20
פיפטבוי	אינטגרה ביוסיינסז	פיפטווי
מלקחיים דקים במיוחד	אגר סיינטיפיק	AGT502
תוכנת זן	זיס	גירסה 2.3

בוי