צביעה אימונופלואורסצנטית של סיאלוגליקופפרוטאינים בתאי אב עצביים ובתאי עצב

תקציר

מקור: Bai, Q., et al., זיהוי סמני פני השטח של התא של תאי גזע עצביים ראשוניים ותאי אב על ידי תיוג מטבולי של סיאלוגליקן. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את הביוטינילציה והתיוג הפלואורסצנטי של סיאלוגליקופרוטאינים שעברו שינוי בתאי גזע עצביים ראשוניים ובתאי אב, כמו גם נוירונים, והדמייתם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

פרוטוקול

1. צביעה אימונופלואורסצנטית של סיאלוגליקופפרוטאינים בתאי עצב ראשוניים מורחבים ובנוירונים ממוינים

1. הכינו BTTAA-CuSO₄ קומפלקס 1 30x המכיל 1.5 mM CuSO₄ ו-9 mM BTTAA במים מזוקקים כפולים. הכינו חיץ מצומד ביוטין טרי 1 המכיל 50 מיקרומטר ביוטין-אלקין, 2.5 מ"מ נתרן אסקורבט וקומפלקס BTTAA-CuSO₄ אחד ב-PBS.
2. מוציאים את התוספות מלוחות התרבות המשותפת. שאפו את מדיום התרבית מהבארות התחתונות ושטפו את התאים העצביים פעם אחת עם PBS שחומם מראש.
3. לשאוף את PBS מן הבארות. הוסף 1 מ"ל של תמיסת PBS פרפורמלדהיד 4% מקוררת מראש לכל באר לתאים וקבע אותם ב- RT למשך 10 דקות. לאחר מכן, לשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS מצונן מראש.
4. שאפו PBS מהבארות והוסיפו 1 מ"ל של חיץ מצומד ביוטין טרי 1 לכל באר לתוך התאים. דגרו על התאים ב-RT למשך 10 דקות.
5. שאפו את חיץ התגובה מהבארות. שטפו את התאים 3 פעמים עם PBS. הכינו את מאגר הצביעה המכיל 1% FBS ו-1 מיקרוגרם/מ"ל Alexa Fluor 647-streptavidin. הוסף 1 מ"ל של חיץ צביעה לכל באר לתוך התאים ודגר על התאים ב RT במשך 30 דקות.
6. שאפו את חיץ הצביעה מהבארות ושטפו תאים 3 פעמים עם PBS מקורר מראש. הכינו את מאגר החסימה המכיל 5% BSA ו-0.3% חומר ניקוי לא יוני-100 ב-PBS. הוסף 1 מ"ל של חיץ חוסם לכל באר לתוך התאים ודגר ב RT במשך 10 דקות.
7. הכינו תמיסת נוגדנים ראשונית על ידי דילול נוגדנים אנטי-נסטין ונוגדנים אנטי-β-טובולין III יחד למאגר החוסם ביחסים של 1:20 ו-1:1,000, בהתאמה. הסר את חיץ החסימה מהבארות והוסף 1 מ"ל של תמיסת נוגדנים ראשונית לכל באר לתוך התאים. לדגור על התאים ב 4 ° C במשך הלילה.
8. הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית מהבארות. שטפו את התאים 3 פעמים עם PBS מקורר מראש. הכן תמיסת נוגדנים משנית על ידי דילול Alexa Fluor 488 עז נגד עכבר IgG1, Alexa Fluor 546 עז נגד עכבר IgG2b ו- DAPI יחד למאגר חוסם בדילול של 1:1,000. שאפו את PBS מהבארות והוסיפו 1 מ"ל תמיסת נוגדנים משנית לכל באר לתאים. לדגור על התאים ב RT במשך 2 שעות.
9. שאפו את תמיסת הנוגדנים מהבארות ושטפו את התאים 3 פעמים עם PBS מקורר מראש. לאחר מכן, התאים מוכנים ללכידת תמונה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סרום בקר עוברי	גיבקו	10099141	10%
פרפורמאלדהיד	סיגמא	158127	4%
דאפי	גיבקו	62248
צלחת 6 בארות	קורנינג	3335
עכבר חד-שבטי אנטי-נסטין	מחקר התפתחותי Hybridoma Bank	חולדה-401	1 עד 20
עכבר חד שבטי אנטי-בטא-טובולין III	סיגמא	T8860	1 עד 1000
Alexa Fluor 488 עז נגד עכבר IgG1	Invitrogen	A-21121	1 עד 1000
Alexa Fluor 546 עז נגד עכבר IgG2b	Invitrogen	A-21143	1 עד 1000
טריטון X-100	אמרסקו	694
נחושת גופרתית	סיגמא	209198
אלקין-ביוטין	לחץ על כלי כימיה	TA105
BTTAA	לחץ על כלי כימיה	1236
נתרן אסקורבט	סיגמא	A4034
קמח אלקסה סטרפטאבידין מצומד 647	Invitrogen	S21374	1 עד 1000