הערכה חוץ גופית של β עמילואיד מצטבר על קריסת חרוט גדילה עצבי

תקציר

מקור: Kuboyama, T. Visualizing Axonal Growth Cone Clapse and Early Amyloid β Effects in Cultured Mouse Neurons. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים הערכה חוץ גופית של קריסת חרוט גדילה עצבי על ידי צברי עמילואיד-β (Aβ). טיפול בנוירונים עם אגרגטים Aβ גורם לערעור יציבות השלד הציטו-שלד, מה שמוביל לקריסת מדוכי צמיחה בקצה האקסונים. התאים המטופלים מושווים לתאי ביקורת כדי להעריך את מידת קריסת חרוט הגדילה.

פרוטוקול

1. כווץ את Assay

1. פולי-D-ליזין coating
   1. צפו מגלשות תרבית של 8 בארות ב-400 מיקרוליטר של פולי-D-ליזין (PDL) במלח חוצץ פוספט (PBS) ודגרו עליהן בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה.
   2. הסר את תמיסת PDL ולשטוף את הבארות 3 פעמים עם מים מזוקקים.
2. תרבות תאי עצב
   1. טחון קליפות מוח טריות שבודדו מעכברי יום עוברי 14 (E14) ddY (דויטשלנד, דנקן ויוקן) עם מיקרומספריים במדיום תרבית נוירונים המכיל 12% נסיוב סוסים, 0.6% גלוקוז ו-2 מילימטר L-גלוטמין (בינוני A). אין להוסיף אנטיביוטיקה.
      הערה: בפרוטוקול זה, עכבר ddY משמש. זהו זן מיושן הנפוץ ביפן. פרוטוקול תרבית תאי עצב זה יכול להיות מיושם גם עבור נוירונים בקליפת המוח של חולדות.
   2. צנטריפוגה את הרקמות ב 87 x גרם במשך 3 דקות.
   3. הסר את supernatant. לאחר מכן לכדור, הוסיפו 2 מ"ל של 0.05% טריפסין ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C. ערבבו על ידי הקשה כל 5 דקות.
   4. הוסף 4 מ"ל של בינוני A וערבב על ידי הקשה.
   5. צנטריפוגה את הרקמות ב 178 x גרם במשך 3 דקות.
   6. הסר את supernatant, ודגר על הרקמות עם 600 U/mL deoxyribonuclease I (DNase I) ו 0.3 מ"ג / מ"ל מעכב טריפסין סויה מומס PBS במשך 15 דקות ב 37 ° C. מערבבים על ידי הקשה כל 5 דקות.
   7. לאחר הדגירה, מוסיפים 4 מ"ל של מדיום A ומערבבים על ידי הקשה.
   8. צנטריפוגה את הרקמות ב 178 x גרם במשך 3 דקות.
   9. לאחר הסרת supernatant, להוסיף 4 מ"ל של בינוני A ו triturate את הרקמות עם פיפטה פסטר מלוטש.
   10. סנן את הרקמות המשולשות עם רשת בגודל 70 מיקרומטר בגודל נקבוביות. לאחר סינון, לחשב את צפיפות התאים עם המוציטומטר.
   11. תרבית את התאים בתרבית 8 בארות מחליקה ב 0.8 x 10⁴ תאים / באר עם מדיום A ולשמור אותם באינקובטור CO₂ עם אטמוספירה לחה של 10% CO₂ ב 37 ° C.
   12. לאחר 4 שעות של תרבית, להחליף את המדיום תרבית אחד המכיל 2% תוספת עבור תרבית עצבית, 0.6% גלוקוז, ו 2 mM L-גלוטמין (בינוני B).
       הערה: טוהר הנוירונים היה כ -75%, כפי שתואר קודם לכן.
3. כווץ את הבדיקה
   1. יש להמיס עמילואיד β1-42 (Aβ1-42) באורך מלא המתקבל מסחרית במים מזוקקים בריכוז של 0.5 mM ולדגור ב-37°C למשך 7 ימים. לאחר הדגירה, אחסנו את תמיסת Aβ1-42 המצטברת במקפיא בטמפרטורה של -30°C עד לשימוש.
      הערה: דגירה זו נחוצה לצבירה ורעילות של Aβ.
   2. לאחר 4 ימים של תרבית עצבית, לטפל בארות עם 100 μL של מדיום B חדש, המכיל 0.5 מיקרומטר מצטבר Aβ1-42 או פתרון רכב (מים מזוקקים) עבור 1 h.
      הערה: ההשפעות של Aβ1-42 הוגדלו באופן תלוי מינון מ-0.1 ל-5 מיקרומטר והגיעו לשיא של 0.5 מיקרומטר כפי שתואר קודם לכן. תוצאות דומות ניתן לראות כאשר על ידי טיפול Aβ1-42 במשך 1 שעה לאחר 3 ימים של תרבות עצבית.
   3. הסר את מדיום התרבית ומיד לתקן את הנוירונים עם 4% paraformaldehyde המכיל 4% סוכרוז PBS במשך 1 שעה ב 37 ° C על צלחת חמה.
   4. לאחר קיבוע, לשטוף את הנוירונים 3 פעמים עם PBS ולהרכיב אותם עם מדיום הרכבה מימי. יבש את אמצעי הרכבה ב 4 ° C במשך 2-4 ימים.
   5. צלם את כל השטח (7.8 x 9 מ"מ²) של כל באר עם עדשת אובייקטיבי יבשה פי 20 במיקרוסקופ הפוך.
   6. סווגו את הנוירוטים הארוכים ביותר של כל נוירון בשלב 3 או 4 כאקסונים, כפי שתואר קודם לכן.
   7. לסווג מדוכי גדילה על פי הקריטריונים הבאים: 1) חרוטי גדילה אקסונליים חסרי למליפודיה או 2) בעלי פחות משלושה פילופודיה נחשבים לקונוסים גדילה שקרסו, כפי שתואר קודם לכן.
      הערה: קונוסים גדילה בריאה הם ניקוד כמו 0 נקודה; מדוכי גדילה שקרסו מקבלים ניקוד של נקודה אחת. ציוני קריסה ממוצעים מחושבים עבור כל טיפול.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
עכברי ddY	SLC
שקופית תרבות של שמונה בארות	בז	354108
פולי D ליזין	וואקו	168-19041
מדיום תרבית, מדיום נוירובזאלי	גיבקו	21103-049
סרום הבית	גיבקו	26050-088
גלוקוז	וואקו	049-31165
ל-גלוטמין	וואקו	074-00522
0.05% טריפסין	גיבקו	25300-054
DNase I	וורטינגטון	DP
מעכב טריפסין פולי סויה	גיבקו	17075-029
מסנן עם גודל רשת שינוי של 70 מיקרומטר, מסננת תאים	בז	352350
תוספת B-27	גיבקו	17504-044
חממת CO2	אסטק	SCA-165DS
עמילואיד β1-42	סיגמא-אולדריץ'	A9810
פרפורמאלדהיד	וואקו	162-16065
סוכרוז	וואקו	196-00015
אמצעי הרכבה מימי, AquaPoly/תושבת	מדעי העל	18606-20
מיקרוסקופ הפוך A	קרל זיס	Axio Observer Z1	מחובר עם AxioCam MRm, יחידת חימום XL S, מודול CO2 S1 ו- TempModule S1
תוכנית אובייקטיבית-אפוכרומט 20x	קרל זיס	420650-9901