כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. הכנת קטעי רקמות לספקטרומטריית מסות הדמיה (IMS)
- עיבוד דגימת רקמה של מוח אנושי שלאחר המוות<br />
הערה: ודא ששלב הכנת הדגימה עבור IMS שומר על המצב המקורי של הרקמה. הימנע זיהום ושינויים לאחר המוות. השלב הבא הוא קריטי.
- השג דגימות קליפת המוח האנושית עבור IMS ממוחות שהוסרו, עובדו ואוחסנו ב -80 ° C בתוך 8 שעות לאחר המוות. קח את דגימת המוח מקליפת המוח העורפית של חולי אלצהיימר (AD) וקבוצת ביקורת תואמת גיל.
- הכנת קטעי רקמות קפואות
- חותכים את קטעי הרקמה על קריוסטט. הניחו את מגלשות זכוכית המיקרוסקופ המוליכות בציפוי אינדיום-בדיל (ITO) בתוך הקריוסטט.
- חממו את דגימת המוח שלאחר המוות מ-80°C עד -22°C בתוך הקריוסטט.
- חברו להב חד פעמי חדש להקפאה לכל ניסוי. נסה תמיד להשתמש בחלק נקי של הלהב.
- הניחו את מוחות הנתיחה הקפואים על הבמה יחד עם כמות קטנה של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) (מספיק כדי לכסות את האזור המרכזי של הבמה; ראו טבלת חומרים).
- בחר את התנאים לחיתוך דק. עבור IMS, השתמש בעובי של 10-12 מיקרומטר עבור קטעי מוח אנושיים. עבור IMS ואימונוהיסטוכימיה (IHC), חתכו חמישה עד שישה מקטעים מכל דגימת רקמה.
- כאשר הלהב רק מתחיל לחתוך את הרקמה, סובבו את הגלגל ו"פנו" לבלוק עד שכל הרקמה נחשפת. אם יש פס קטן או קרע לאורך הקטע, המתן עוד קצת בהקפאה עד שהתאמת הטמפרטורה תתקן אותו באופן אוטומטי. ספרו כמה שניות לפני פתיחת האנטי-רול עם טישו מתחת.
- הניחו מיד את פרוסת הרקמה על הצד המצופה ITO של מגלשת הזכוכית. הפשירו את פרוסת הרקמה על ידי הכנסת אצבע מתחת לשקופית בצד שאינו מצופה ITO. הרקמה תידבק לשקופית; ודא כי הרקמה שטוחה ככל האפשר ללא קמטים. בצע שלב זה בטמפרטורת החדר.
הערה: יש ללבוש כפפות, מסכות וחלוק מעבדה מכיוון שהדגימות האנושיות עלולות להכיל מזהמים ביולוגיים. לאחר שכל החלקים הוכנו ליום, נקו את הקריוסטט, המברשות והצ'אקים עם מגבוני מעבדה ו-200 מ"ל של 100% אתנול.
- שטיפת חלקי הרקמה
- לטבול את הדגימות 40-100 מ"ל של 70% אתנול במשך 30 s כדי להסיר שומנים אנדוגניים ומלחים אנאורגניים. השתמשו בצנצנת צביעת זכוכית.
- שטפו את הדגימות עם 40-100 מ"ל של 100% אתנול במשך 30 שניות, 40-100 מ"ל של תמיסה של קרנוי במשך 3 דקות, 40-100 מ"ל של 100% אתנול במשך 30 שניות, 40-100 מ"ל של 0.1% חומצה טריפלואורואצטית (TFA) למשך דקה אחת, ו-40-100 מ"ל של 100% אתנול למשך 30 שניות. השתמש בצנצנת צביעת זכוכית.
הערה: התמיסה של קרנוי היא קיבוע המורכב משישה חלקים אתנול, שלושה חלקים חומצה אצטית וחלק אחד כלורופורם.
- יבש בוואקום במשך 30 דקות.
- טיפול בקטעי הרקמה עם אדי חומצה פורמית ליינון טוב יותר של חלבוני Aβ מרקמות מוח נתיחה שלאחר המוות
- הכינו את התנור ואת מגלשת זכוכית הדגירה שישמשו לאידוי הבא עם 5 מ"ל של 100% חומצה פורמית. כדי להשיג טיפול חומצי משביע רצון, יש לשמור על לחות האוויר בצלחת זכוכית הדגירה ברמת רוויה לאורך שלב זה ולשמור על טמפרטורה של 60°C. הניחו את מגלשות הרקמה בצלחת זכוכית הדגירה תוך הימנעות מטבילה בחומצה הפורמית וטפלו במשך 6 דקות.
- צלם תמונה אופטית של הדגימות באמצעות סורק פילם, סורק ג'ל, מיקרוסקופ דיגיטלי וכו '. בצע שלב זה בטמפרטורת החדר. יישור התמונה האופטית של הדגימות נחוץ כאשר יעד הדגימה ממוקם בתוך המכשיר. בדרך כלל, לא ניתן יהיה לזהות את קטע הרקמה מתחת לשכבת המטריצה.
הערה: הדרך הנוחה ביותר לצלם תמונה אופטית היא להשתמש בסורק משרדי. מומלץ לשמור את התמונה בתיקיית אחסון נתוני ההדמיה.
- כדי להתאים את התמונות האופטיות לדגימות, צור סימני מנחה הנראים הן בתמונה האופטית והן מתחת לשכבת המטריצה במצלמה האופטית. הדרך הקלה ביותר היא לזהות לפחות שלושה סימני נוזל תיקון סביב הדגימה לפני צילום התמונה האופטית.
- יישום מטריקס
- הכנת פתרון המטריצה
- במיקרו-צינורית אורגנית עמידה לממסים, הכינו תמיסת חומצה סינאפינית (SA) במינון 10 מ"ג/מ"ל ב-50% אצטוניטריל (ACN) ו-0.1% TFA. יש להמיס היטב את תרכובת חומצה סליצילית על ידי מערבול או סוניקציה קצרה למשך 10 דקות. יש לאחסן את התמיסה בטמפרטורת החדר עד לשימוש.
הערה: ישנן שלוש אפשרויות שונות לריסוס מטריצה: שימוש במברשת אוויר, מרסס על-קולי או מרסס אוטומטי.
- ריסוס המטריצה במברשת אוויר
- בצע את הפעולה בטמפרטורת חדר קבועה (20-23 מעלות צלזיוס) ולחות (40%-60%). הפרמטרים שיש להתאים לריסוס אופטימלי כוללים את גודל הטיפה, כמות הערפל, הזווית והמרחק בין פיית ההתזה לחלק הרקמה, הטמפרטורה והלחות במעבדה. התאם תנאים אלה על ידי בדיקת תוצאות המיקרוסקופ.
הערה: מכיוון שגורמים מגבילים כוללים את גודל הגביש וההומוגניות של כיסוי המטריצה ואת הנדידה/דיפוזיה הבלתי רצויה של אנליטים, קטן יותר עדיף לגודל הטיפה. הומוגניות היא גם נקודת הבדיקה.
- ריסוס המטריצה במרסס קולי
- הסר את הרקמה שיש לרסס ממייבש והניחו אותה בחדר. ודא שהרקמה אינה מכסה את חלון החיישן.
- התחל את ההכנה על ידי לחיצה על לחצן התחל; בדרך כלל, זמן ההכנה הוא סביב 90 דקות. התכשיר יוסדר אוטומטית באמצעות ניטור עובי שכבת המטריצה והרטיבות. לאחר השלמת ההכנה, הסר את השקופית ואחסן אותה במייבש למשך 15 דקות לפני קריאתה במכשיר MALDI.
- נקו את המרסס עם 2-3 מ"ל של 100% מתנול (MeOH) עד שראש הריסוס נראה נקי.
הערה: ערפל דק של טיפות מטריצה מורשה לשקוע ברקמה על ידי יריעת כבידה. גודל טיפה ממוצע של 20 מיקרומטר נוצר; כל קוטר הטיפות קטן מ-50 מיקרומטר.
- ריסוס המטריצה במרסס אוטומטי
- רססו את תמיסת המטריצה על פני הרקמה במרסס אוטומטי. זרימה קבועה של גז נדן מחומם (N2, מוגדר על 10 psi ו 75 ° C) יועבר יחד עם תרסיס פתרון מטריצה. השתמש במערכת משאבת ממס (מוגדר על 10 psi ו- 0.15 מ"ל לדקה) כדי לספק את פתרון המטריצה.
הערה: והכי חשוב, לעבוד תחת ארון בטיחות כדי למנוע כל שאיפה של אירוסולים מטריצה. שלוט בטמפרטורת החדר ובלחות כדי לשחזר התגבשות מטריצה הומוגנית.
2. MALDI-IMS
- בצע ספקטרומטריית מסות במהירות גבוהה במיוחד.
- בצע ניסויי הדמיה בתפוקה גבוהה וברזולוציה מרחבית גבוהה עם MALDI-IMS המצויד בלייזר איטריום אלומיניום מסומם ניאודימיום (Nd:YAG, 355 nm) מסומם ניאודימיום 10 קילוהרץ.
- למדידות ספקטרומטריית מסות, הגדר את אזורי הרקמה באמצעות תוכנת הבקרה MALDI ותוכנת ניתוח הנתונים.
- קבל ספקטרום במצב ליניארי חיובי עם טווח מסה של m/z 2,000-20,000 ורזולוציה מרחבית של 20 ו-100 מיקרומטר.
- כדי להפוך את תקן הכיול, יש להמיס את תקן כיול הפפטיד ואת תקן כיול החלבונים ביחס של 1:4 עם חומצה אלפא-ציאנו-4-הידרוקסיל-קינמית (CHCA) בתמיסת TA30 (ACN:0.1% TFA = 30:70) ולאחר מכן לדלל אותו פי 10. יש להניח 1 μL של תקן כיול על השקופית בארבעה מיקומים שונים.
- באמצעות תוכנת היסטולוגיה מולקולרית (ראו טבלת חומרים), כיסו תמונות בודדות מרובות כדי למצוא את המתאם המרחבי של אותות שונים, כגון פפטידים שונים של Aβ המשתלבים ברבדים סניליים (SPs) ובדפנות עורקים.
