איתור מיקרו-דימומים מוחיים במודל חולדה

תקציר

מקור: Li, D., Zhào, H., et al. דימומים מוחיים תת-חריפים המושרים על ידי הזרקת ליפופוליסכריד בחולדות. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים בדיקה לזיהוי מיקרו-דימומים מוחיים (CMHs) במודל חולדה. CMHs הם דימומים מוחיים עקב הפרעה במחסום הדם-מוח, המזוהים על ידי תאי דם אדומים שדלפו (RBCs). במודל של חולדה, רקמת מוח קבועה מוגנת בהקפאה, חתוכה ומוכתמת בהמטוקסילין-אאוזין עבור RBCs, מה שמאפשר הדמיה מיקרוסקופית של CMHs. RBCs שדלפו מופיעים כאדומים-כתומים מתחת למיקרוסקופ.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. חומרים

1. הכנת הזרקת ליפופוליסכריד (LPS)
   1. יש להוסיף 25 מ"ל מים מזוקקים ל-25 מ"ג אבקת LPS שמקורה בסלמונלה טיפימוריום לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל. יש לאחסן את ההזרקה בצינור סטרילי בטמפרטורה של 4°C.
      זהירות: LPS הוא רעיל.
   2. הכינו תמיסת 2% Evans blue (EB) בתמיסת מלח רגילה של 0.9% כדי לשמור על הזרקת EB בריכוז עבודה.

2. בעלי חיים

מתן LPS לחולדות Sprague-Dawley (SD) זכר, בגיל 10 שבועות (משקל ממוצע: 280 ± 20 גרם) על ידי הזרקה intraperitoneal.
זהירות: אם חולדות נרכשות מארגון אחר, אז שלב ההסתגלות לא צריך להיות פחות מ 7 ימים.

3. זריקות LPS

1. הזריקו LPS תוך צפקי לכל חולדה במינון של 1 מ"ג/ק"ג והחזירו את החולדות לכלוב הביתי שלהן.
   הערה: אין צורך בהרדמה.
2. שש שעות לאחר מכן, הזריקו את אותה מנה של הזרקת LPS לחולדות.
3. שש עשרה שעות לאחר מכן הזריקו את אותה מנה של LPS לחולדות.
   זהירות: הזרקת LPS לחולדות SD במינון של 1 מ"ג/ק"ג עלולה לגרום לשיעור תמותה של 5%. שיעור התמותה עלול לעלות עוד יותר בחולדות צעירות או מבוגרות יותר או בחולדות הרות.
4. החזירו את החולדות לכלובים שלהן לאחר הזרקת LPS וספקו ל-ad libitum גישה למזון ולשתייה.
   הערה: חולדות יפגינו תגובה דלקתית מערכתית מובהקת, ולכן חיוני שהכלובים יישארו נקיים לאורך כל הניסוי. חולדות צריכות להיות במעקב תכוף (2x יום) אחר משקל, מראה כללי וגישה לאחר הזרקת LPS הראשונה. אם החולדות מתחילות להפגין יציבה כפופה, חוסר רצון לזוז, ירידה משמעותית במשקל (>20%), כתמי פורפירין שמרדימים אותן באופן הומני לפני נקודת הסיום של מחקר EB בן 7 ימים.

4. אוסף דוגמאות

1. הזרקת EB
   1. שבעה ימים לאחר הזריקה הראשונה, יש להרדים את החולדה תוך צפקית בהתאם לפרוטוקול IACUC המאושר שלך.
   2. המתינו 1-2 דקות עד שהחולדות לא יראו תגובות רפלקס בקרנית. לבצע ניקוב לב בעומק 5-8 מ"מ על כל חולדה; נקודת הניקוב צריכה להיות 5 מ"מ לשוליים השמאליים של עצם החזה בחלל הבין-קוסטלי השלישי והרביעי.
   3. המתן עד להתאוששות הדם, ולאחר מכן הזריק EB במינון של 0.2 מ"ל / 100 גרם משקל גוף לחדר הלב השמאלי.
      זהירות: ניקוב לב והזרקת EB צריכים להתבצע בקפידה. EB עשוי להיות מוזרק לתוך חלל החזה או קרום הלב במקום חדר הלב השמאלי.
      1. יש למצוץ בחזרה עם צינורית ריקה ולהחליף נפח זה בצינורית EB לפני ההזרקה כדי לסייע בהפחתת שיעור הכשל (למשל, הזרקה לכלוב צלעות בטעות).
   4. החזיקו את החולדה במצב שכיבה למשך 10 דקות.
      הערה: אם הדגימה אינה משמשת לזיהוי דליפת EB בהדמיה אימונופלואורסצנטית, ייתכן ששלב זה יושמט.
2. התבוננות גסה
   1. בצע זילוח לב באמצעות מלח חיץ פוספט 1M קר כקרח (PBS) כדי לנקות את כלי הדם במוח ואת המוח.
      1. באמצעות אזמל, לבצע חתך בטן לכל אורך הסרעפת.
      2. חותכים דרך צלעות ממש משמאל לקו האמצע של כלוב הצלעות.
      3. פתח את חלל בית החזה. השתמש מלחציים כדי לחשוף את הלב כדי להקל על ניקוז של דם ונוזלים אחרים.
      4. תוך כדי אחיזה יציבה של הלב במלקחיים (הלב עדיין צריך לפעום), הכנס ישירות מחט לבליטה של החדר השמאלי כדי להאריך זאת לכ -5 מ"מ. אבטח את המחט במיקום זה על ידי הידוק ליד נקודת הכניסה.
         זהירות: אין להאריך יתר על המידה את המחט, כפי שהוא יכול לחדור את הקיר הפנימי ולסכן את זרימת התמיסות.
      5. שחררו את השסתום כדי לאפשר זרימה של תמיסת PBS קרה כקרח (200-300 מ"ל) בקצב איטי ויציב בסביבות 20 מ"ל/דקה באמצעות משאבת זילוח. אם בעלי החיים דורשים קיבוע במקום תצפית גסה, אז להשתמש באותו מינון של תמיסת מליחות קרה כקרח 0.9%.
      6. באמצעות מספריים חדים, לבצע חתך באטריום, להבטיח כי הפתרון זורם ברציפות. אם הנוזל אינו זורם בחופשיות או מגיע מהנחיריים או מהפה של החיה, מקם מחדש את המחט.
   2. מסך עבור CMHs על ידי תצפית גסה.
      הערה: אם המדגם אינו משמש לחישוב מספר CMHs על ידי תצפית ברוטו, אז שלב זה עשוי להיות מושמט.
3. קיבוע
   1. בצע זילוח לב באמצעות תמיסת מלח 0.9% קרה כקרח (200-300 מ"ל) כדי לנקות את כלי הדם במוח ואת המוח.
   2. בצע זילוח לב באמצעות 4% paraformaldehyde קר כקרח לקיבוע.
   3. ערפו את ראשה של החולדה, בודדו את המוח וטבלו את המוח בתמיסת 20% סוכרוז למשך 6 שעות לפחות.
   4. לשנות את הפתרון לתוך 30% סוכרוז ולתקן עוד 6 שעות.
4. הכינו קטעי רקמות מוח בעובי 10 מ"מ באמצעות קריוסטט.

5. צביעת Hematoxylin ו-eosin (HE)

הערה: הליך זה מבוצע באמצעות ערכת צביעה HE.

1. שטפו את המגלשות במים מזוקקים.
2. יש לצבוע בתמיסת המטוקסילין למשך 8 דקות. לשטוף במי ברז זורמים למשך 5 דקות.
3. יש להבדיל ב-1% אלכוהול חומצי למשך 30 שניות. יש לשטוף במי ברז זורמים למשך דקה.
4. יש לצבוע במי אמוניה 0.2% (Bluing) או בתמיסת ליתיום קרבונט רווי למשך 30 שניות עד דקה אחת. יש לשטוף במי ברז זורמים למשך 5 דקות.
5. יש לשטוף ב-95% אלכוהול (10 מטבלים).
6. כתם נגדי עם תמיסת אאוזין למשך 30 שניות עד דקה אחת.
7. יש לייבש באמצעות 95% אלכוהול, שתי החלפות של אלכוהול מוחלט, למשך 5 דקות כל אחת.
8. נקה בקסילן למשך 30 שניות.
9. הר בשיטה של ליו.
10. ניתוח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי brightfield.
    הערה: תאי דם אדומים המשתחררים מכלי הדם, שהם המרכיבים של CMHs, מופיעים באדום-כתום תחת צביעת HE.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
LPS	סיגמא-אולדריץ'	L-2630	להשראת דלקת
EB	סיגמא-אולדריץ'	E2129	לאיתור נזילות EB
הוא מכתים	סולארביו	G1120	ערכה לצביעת HE
כלורל הידרט	סיגמא-אולדריץ'	47335U	להרדמה
מלח חיץ פוספט (PBS)	סולארביו	עמ' 1022	סוג של פתרון חיץ נפוץ בניסוי
0.9% תמיסת מלח	Hainan DonglianChangfu פרמצבטיקה ושות', בע"מ, סין		פתרון לזילוח
פרפורמאלדהיד	סיגמא-אולדריץ'	158127	סוג של פתרון נפוץ לקיבוע
תמיסת 20% סוכרוז	סולארביו	G2461	סוג של פתרון נפוץ לקיבוע
תמיסת 30% סוכרוז	סולארביו	G2460	סוג של פתרון נפוץ לקיבוע
משחה וטרינרית	ג'ל עיניים Solcoseryl, Bacel, שוויץ		להגנה על עיני חולדה