$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.
1. תרבית תאים ראשונית בהיפוקמפוס
- הכינו את תרבית התאים המנותקת של היפוקמפוס החולדה ביום העוברי ה-19. לוחים את התאים על כיסויים בקוטר 12 מ"מ המצופים בפוליאתילנימין (PEI) בצלחות של 24 בארות בצפיפות של 50,000 - 60,000 תאים/באר. בדוק את הצפיפות באמצעות תא ספירת תאים ואופטיקת ניגודיות פאזה.
- תרבית את הנוירונים במשך 3 ימים (יום במבחנה (DIV) 3) בצלחת 24 בארות באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2.
- הערך את הכיסויים עבור אינדיקטורים לבריאות התא באמצעות מיקרוסקופ אור מועבר (למשל, אופטיקת ניגודיות פאזה בהגדלה של 10 - 20X). בדוק את האינדיקטורים הבאים לבריאות טובה: הילת ניגודיות שלב ברורה, נוירוטים ללא מבני חרוזים, וללא אשכולות סומא או צרור נוריט.
2. טרנספקציה
NOTE: הפרוטוקול הבא מתייחס להעברה כפולה עבור 3 בארות. עם זאת, הפרוטוקול עובד בצורה הטובה ביותר כאשר מכינים כמויות המספיקות ל -4 בארות.
- הכן 500 מ"ל של חיץ טרנספקציה (274 מ"מ נתרן כלורי, NaCl, 10 מ"מ אשלגן כלורי, KCl, 1.4 מ"מ דיסודיום מימן פוספט, Na2HPO4, 15 מ"מ גלוקוז, 42 מ"מ 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזיןאתאן-חומצה סולפונית, HEPES) בצלוחית ארלנמאייר.
- ממיסים 8.0 גרם NaCl, 0.37 גרם KCl, 0.095 גרם של Na2HPO4, 1.35 גרם גלוקוז ו-5.0 גרם HEPES ב-400 מ"ל מים מזוקקים בצלוחית Erlenmeyer.
- התאם את ה- pH ל- 6.95 עם 1 M נתרן הידרוקסידי, NaOH באמצעות מד pH.
- כוונן את עוצמת הקול עם מים מזוקקים ל 500 מ"ל ובדוק את ה- pH באמצעות מד pH.
- הפוך 20 - 30 מ"ל aliquots של חיץ transfection עם ערכי pH הבאים על ידי pipetting 1 M NaOH למאגר transfection: 6.96, 6.97, 6.98, 6.99, 7.00, 7.01, 7.02, 7.03, 7.04, 7.05, 7.06, 7.07, 7.08, 7.09, 7.11.
הערה: ה- pH של מאגר הטרנספקציה חיוני ליעילות הטרנספקציה.
- כדי לבדוק איזה מאגר טרנספקציה מוביל למספר הגבוה ביותר של תאים נגועים, בדוק כל ערך pH מ- 6.96 ל- 7.11. השתמש בשיטת הטרנספקציה המתוארת ב 2.2 - 2.11 ובפלסמיד מאומת המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). קבע את מספר התאים הנגועים לכל כיסוי, עבור כל ערך pH של מאגר טרנספקציה כדי להעריך איזה מאגר עובד בצורה הטובה ביותר.
- Aliquot את החיץ עם יעילות transfection הגבוהה ביותר לתוך 2 מ"ל צינורות microcentrifuge להקפיא ולאחסן את הצינורות ב -20 ° C.
- מחממים מראש את מדיום הסרום המופחת, מדיום תרבית התאים ומים מזוקקים ל -37 מעלות צלזיוס באמבט המים.
- הכן את תערובת transfection בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. עבוד מתחת למכסה המנוע של זרימה למינרית כדי להבטיח תנאי עבודה סטריליים.
- ערבבו 7.5 מיקרוליטר של 2 M סידן כלורי עם 4 מיקרוגרם של כל DNA נטול אנדוטוקסין (Synaptophysin-mOrange ו-mGFP/GFP-Rogdi). הוסף מים כדי להגיע לנפח כולל של 60 μL בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.
- הוסף 60 μL של מאגר transfection לתערובת. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר, הוסף את מאגר הטרנספקציה טיפה תוך ניעור עדין של תערובת הדנ"א על המערבולת.
- יש לדגור בטמפרטורת החדר (RT) למשך 20 דקות. הימנע מטלטול צינור הדגירה בזמן הדגירה על ידי הנחת הצינור ליד מכסה המנוע של הזרימה הלמינרית.
- מתחת למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית, מוציאים את מדיום תרבית התאים ("התווך המותנה") מהבארות באמצעות צינור של 1000 מיקרוליטר ומאחסנים אותו במיכל נפרד באינקובטור.
- הוסיפו 500 μL של מדיום סרום מופחת לכל באר. יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 עד לסיום תקופת הדגירה בת 20 הדקות (שלב 2.3.3).
- מוסיפים 30 μL של תערובת transfection לכל באר על ידי pipetting כמה טיפות. יש להשליך את השאריות בתחתית הצינור.
- לאחר שכל הבארות סופקו עם תערובת transfection, לנער בעדינות את צלחת 24 בארות כדי להבטיח את הפיזור של תערובת transfection בתווך.
- לדגור על הבארות במשך 60 דקות ב 37 ° C ו 5% CO2.
- מוציאים ומשליכים את תערובת הטרנספקציה ושוטפים אותה שלוש פעמים במדיום תרבית תאים. הוסף 1 מ"ל של מדיום תרבית תאים לכל באר ודגר עליהם במשך 30 שניות ב- RT. הסר 750 μL של מדיום והוסף את אותה כמות של מדיום טרי. חזור על פעולה זו שלוש פעמים.
הערה: שלב הכביסה הוא קריטי. שמרו על זמן מינימלי שבו לכל באר אין מדיום (כלומר, הסירו והחליפו היטב היטב) והוסיפו את אמצעי הכביסה בעדינות.
- מוציאים ומשליכים את מדיום תרבית התאים ומוסיפים 450 מיקרוליטר של המדיום המותנה היטב.
- תנו לנוירונים להתבגר באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2 עד DIV 10.
3. גירוי וקליטת Syt1
NOTE: הפרוטוקול הבא מחיל את הספיגה על 3 בארות. עבור depolarization של כל מספר אחר של בארות, להתאים את הכמויות בהתאם.
- הכן 50 מ"ל של חיץ דפולריזציה 10x (640 mM NaCl, 700 mM KCl, 10 mM מגנזיום כלורי, MgCl2, 20 mM סידן כלורי, CaCl2, 300 mM גלוקוז, 200 mM HEPES, pH 7.4) בצלוחית Erlenmeyer.
הערה: ניתן לשמור את מאגר הדפולריזציה בטמפרטורה של 4°C למשך מספר שבועות. אם משתמשים גם בתמיסה לא דפולריזציה, הכינו תמיסה של 10x Tyrode המורכבת מ- 1290 mM NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM גלוקוז, 200 mM HEPES pH 7.4 על מנת להשוות מיחזור המושרה על ידי גירוי למיחזור ספונטני. לאחר דילול ל-1x, יש להוסיף 1 מיקרומטר של טטרודוטוקסין לפני השימוש כדי לחסום יצירת פוטנציאל פעולה.
- להמיס 1.87 גרם של NaCl, 2.61 גרם של KCl, 0.1 גרם של MgCl2-6H 2O, 0.15 גרם של CaCl2-2H 2O ו 3.0 גרם של גלוקוז-1 H2O ו 2.38 גרם של HEPES ב 50 מ"ל של מים מזוקקים בבקבוק Erlenmeyer. כוונן את רמת החומציות עם NaOH וסנן סטרילי את התמיסה. יש לדלל את החיץ ביחס 1:10 במים מזוקקים לקבלת ריכוז של 1x.
- הכינו 4% פרפורמאלדהיד (PFA) במי מלח חוצצי פוספט (PBS) (pH 7.4) לקיבוע לאחר גירוי.
- עבור 500 מ"ל של 4% PFA ב-1x PBS, יש להמיס 20 גרם של פרפורמלדהיד ב-450 מ"ל של H2O. מזוקק
הערה: חימום התמיסה עשוי להאיץ את המסת התמיסה אך אין לחמם את התמיסה מעל 70°C, מכיוון שה-PFA עלול להתפורר.
זהירות: PFA הוא רעיל, מסרטן פוטנציאלי וטרטוגני. יש ללבוש כפפות בעת עבודה עם PFA, לעבוד מתחת למכסה המנוע ולהימנע מבליעה.
- תן לפתרון להתקרר ל- RT והוסף 50 מ"ל של פתרון מלאי PBS פי 10. כוונן את ה- pH ל- 7.4 עם NaOH/HCl (חומצה הידרוכלורית) באמצעות מד pH.
- טרום חם 600 μL של 1x חיץ depolarization ו 10 מ"ל של תרבית תאים בינוני עד 37 ° C באמבט המים.
- הוסף 1 μL של נוגדן אנטי-Syt1 עכבר (שיבוט 604.2) למאגר הדפולריזציה ולמערבולת 1x למשך 10 שניות.
- הסר והשלך את מדיום תרבית התאים מהתאים. מוסיפים 200 μL של תערובת נוגדנים דפולריזציה-נוגדנים לכל באר ודגרים במשך 5 דקות ב-37°C ו-5%CO2 באינקובטור.
- מוציאים ומשליכים את תערובת הנוגדנים לדפולריזציה ושוטפים אותה שלוש פעמים במדיום תרבית תאים. הוסף 1 מ"ל של מדיום תרבית תאים לכל באר ודגר במשך 30 שניות ב- RT. הסר 750 מיקרוליטר של מדיום והוסף את אותה כמות של מדיום טרי. חזור על הפעולה שלוש פעמים.
- הסר והשליך את מדיום תרבית התאים והוסף 300 μL של 4% PFA ב- 1x PBS. יש לדגור במשך 20 דקות ב-4°C.
- שטפו שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת עם 1x PBS.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
4. אימונוציטוכימיה
- הכן 50 מ"ל של חיץ חוסם.
הערה: ניתן לשמור על חיץ חוסם בטמפרטורה של -20°C למשך מספר חודשים.
- ממיסים 2.5 גרם סוכרוז ו-1 גרם אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-5 מ"ל של תמיסת מלאי PBS 10x. הוסף 1.5 מ"ל של 10% תמיסת מלאי חומרי ניקוי. מערבבים את התמיסה עד שכל הרכיבים מתמוססים כראוי ומוסיפים H2O מזוקק עד לקבלת נפח סופי של 50 מ"ל. Aliquot הפתרון ולהקפיא את aliquots לאחסון.
- לדלל את הנוגדן השניוני, מצומד פלואורופור (מכוון נגד המין הראשוני Syt1-נוגדנים) ב 200 μL של חיץ חוסם בכל באר בדילול של 1:1000.
- הסר והשלך את 1x PBS מכל באר המכילה כיסוי.
- הוסף 200 μL של תערובת נוגדנים חוצצת חוסמת לכל באר ודגר במשך 60 דקות ב RT.
זהירות: מכיוון שהנוגדנים המשניים רגישים לאור, כל הצעדים הנעים קדימה חייבים להתבצע בחושך.
- לאחר הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים במשך 5 דקות עם 1 מ"ל של 1x PBS.
- הטמע את הכיסויים על שקופיות מיקרוסקופ עם מדיום ההטבעה.
- הוסף טיפה של 7 μL של מדיום הטבעה על שקופית המיקרוסקופ. הסר את הכיסוי מהצלחת בת 24 הבארות על ידי הרמתו עם מזרק ותפיסתו במלקחיים.
זהירות: תאים על פני השטח של הכיסוי ניזוקים בקלות, ולכן יש לטפל במלקחיים בזהירות.
- טבלו את הכיסוי במים מזוקקים כדי להסיר את PBS וייבשו אותו בזהירות על ידי נגיעה בקצה אחד ברקמה רכה.
- הפכו את הכיסוי על טיפת המדיום ההטבעה, כך שהמשטח הנושא את התאים פונה לשקופית המיקרוסקופ, ובכך הטמיעו את התאים בתווך ההטבעה.
- השאירו את המגלשות להתייבש מתחת למכסה המנוע למשך 1-2 שעות (כסו אותן כדי למנוע חשיפה לאור) ואחסנו אותן בקופסת שקופיות במיקרוסקופ בטמפרטורה של 4°C.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.