אימונוסטיין של נוירונים שטופלו בצברי אלפא-סינוקלאין

תקציר

מקור: Panattoni, G., et al. ניהול אקסוגני של אגרגטים אלפא-סינוקלאין הקשורים למיקרוזומים לנוירונים ראשוניים כמודל תאי רב עוצמה של היווצרות סיבים. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את ההכתמה החיסונית של תאי עצב המטופלים בצברי אלפא-סינוקלאין (αS). תאי העצב מטופלים תחילה באמצעות אגרגטים αS. לאחר מכן הם קבועים, חדירים ומטופלים בתמיסת חסימה. נוגדנים ראשוניים מתווספים, ואחריו נוגדנים משניים המסומנים פלואורסצנטית וכתם גרעיני. לאחר מכן הדגימה מורכבת ונצפית תחת מיקרוסקופ.

פרוטוקול

1. טיפול בנוירונים

הערה: הטיפול בוצע בחטיבה (DIV) 7. כל השלבים מתבצעים תחת מכסה מנוע של תרבית תאים בתנאים סטריליים. דוגמה לצפיפות תרבית עצבית בקליפת המוח ב-DIV 7 מודגמת באיור 1.

1. אגרגטים αS הקשורים למיקרוזומים המתקבלים מחוט השדרה של שלושה עכברים טרנסגניים חולים שונים כדי לקבל תמיסה של 1 מיקרוגרם/μL, תוך שימוש במאגר ההומוגניזציה המקורי [המורכב מסוכרוז של 250 mM, 20 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), 10 mM KCl (אשלגן כלורי), 1.5 mM MgCl₂ ( (מגנזיום כלורי), 2 mM EDTA (חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית), ו-1x פוספטאז/מעכבי פרוטאז] לדילול.
2. קח תרבית נוירונים על כיסויי פולי-D-ליזין ב -24 צלחות באר המכילות בינוני (2% B27, 10x גנטמיצין, ו 2 mM גלוטמין). הסר 1/3 מהמדיום והחלף אותו בעדינות בתווך טרי המכיל 2% B27, 1x גנטמיצין ו-2 mM גלוטמין.
3. הוסף 1 מיקרוגרם של אגרגטים אלפא-סינוקלאין (αS) הקשורים למיקרוזומים למדיום התא. להחזיר נוירונים לאינקובטור ב 37 °C (77 °F).
4. כל 3 ימים במשך שבוע, להוסיף 1/3 של בינוני טרי. אל תחליף את המדיום. פשוט להוסיף אותו.
5. לאחר שבוע של טיפול, יש להסיר 1/3 מהמדיום ולהחליף אותו בעדינות בתווך הטרי המכיל 2% B27, 10 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין ו-2 מ"מ גלוטמין. חזור על הפעולה כל 3 ימים.
6. תקן נוירונים לאחר שבועיים של טיפול (DIV 21).

2. אימונופלואורסנציה

1. תקן תאי עצב עם 2% paraformaldehyde בתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) 1x ו-5% סוכרוז למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) מבלי לרעוד מתחת למכסה האדים הכימי.
2. הסר את פתרון התיקון. שטפו בקצרה עם PBS 1x, 3 פעמים.
   הערה: בצעו את כל שלבי הכביסה בעדינות מכיוון שתאי עצב ראשוניים אינם נדבקים היטב לכיסויי פולי-ליזין.
3. חדיר נוירונים עם 0.3% של פעילי שטח לא יוניים ב- PBS 1x למשך 5 דקות ב- RT.
4. שטפו בקצרה עם PBS 1x, 3 פעמים.
5. דגרו על תאי עצב עם 3% סרום בקר עוברי (FBS) ב-PBS 1x למשך 30 דקות ב-RT כדי לחסום אתרי קשירה לא ספציפיים בשייקר מסלולי.
6. לדגור נוירונים עם נוגדן ראשוני מתאים מומס ב 3% FBS ב PBS 1x, O/N ב 4 ° C על שייקר מסלולי.
   הערה: נעשה שימוש בנוגדנים syn303 (1:1,000), αS של עכבר (1:200), pser129-αS (1:1,000) וטאו (1:10,000).
7. הסר את תמיסת הנוגדנים ושטף, לזמן קצר, עם PBS 1x, 3 פעמים.
8. לדגור נוירונים עם נוגדן משני פלואורסצנטי מתאים מומס ב 3% FBS ב PBS במשך 1 שעה ב RT בחושך על שייקר מסלולי.
9. הסר את תמיסת הנוגדנים ושטף, לזמן קצר, עם PBS 1x, 3 פעמים.
10. צביעת נוירונים עם תמיסת DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) (0.1 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS 1x) למשך 15 דקות ב-RT בחושך על שייקר מסלולי.
11. הסר את תמיסת הנוגדנים ושטף, לזמן קצר, עם PBS 1x, 3 פעמים.
12. הרכבה מכסה מחליקים על שקופית באמצעות אמצעי הרכבה נגד דהייה.

תוצאות

איור 1. תרבויות נוירונים קורטיקליים. תמונה מייצגת המציגה צפיפות ב-DIV 7 של תרביות נוירונים בקליפת המוח. התמונות צולמו במיקרוסקופ אור הפוך, 10X אובייקטיבי. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סוכרוז	סיגמא-אולדריץ'	84097-1 ק"ג
Hepes	סיגמא-אולדריץ'	H0887-100ML	1M pH=7-7.6
EDTA	סיגמא-אולדריץ'	0390-100 מ"ל	pH=8 0.5M
מגנזיום כלורי	סיגמא-אולדריץ'	M8266-100G
נתרן פחמתי	סיגמא-אולדריץ'	S7795-500G
סודיום ביקרבונט	סיגמא-אולדריץ'	S5761-500G
מתנול	סיגמא-אולדריץ'	322415-6X1L
KCl	סיגמא-אולדריץ'	P9541-500G
cOmplete מיני	רוש	11836170001	מעכב פרוטאז
פוסטופ	רוש	4906837001	מעכב phosphatase
ערכת בדיקת חלבון BCA	יורושיבוט	EMPO14500
קריטריון TGX 4-20% ללא כתמים, 18 בארות	ביוראד	5678094
קרום ניטרוצלולוז נתמך	ביוראד	1620097	0.2 מיקרומטר
חוסם בדרגת כתמים	ביוראד	1706404	חלב יבש ללא שומן
מצע כימילומינסנט SuperSignal West Pico	תרמו פישר סיינטיפיק	34077
חומצה חנקתית	סיגמא-אולדריץ'	1004411000	65%
כיסויי זכוכית	תרמו פישר סיינטיפיק	1014355118NR1	18 מ " מ x
פולי-די-ליזין	סיגמא-אולדריץ'	P7280
תמיסת המלח המאוזנת של האנק	תרמו פישר סיינטיפיק	14170-500 מ"ל
פניצילין/סטרפטומיצין	תרמו פישר סיינטיפיק	15140122	10,000 U/מ"ל, 100 מ"ל
מדיום הנשר המעובד של דולבקו	תרמו פישר סיינטיפיק	D5796-500 מ"ל
טריפסין-EDTA	תרמו פישר סיינטיפיק	15400054	0.50%
תוסף B27	תרמו פישר סיינטיפיק	17504044	פי 50
גלוטמקס	תרמו פישר סיינטיפיק	35050-038	פי 100
DNAse	סיגמא-אולדריץ'	D5025
סרום בקר עוברי	יורושיבוט	EC50182L
גלוטמט	סיגמא-אולדריץ'	1446600-1G
גנטמיצין	תרמו פישר סיינטיפיק	15710	10 מ"ג/מ"ל
מדיום נוירובזלי	תרמו פישר סיינטיפיק	10888-022
ציטוזין אראבינוסיד (AraC)	סיגמא-אולדריץ'	C3350000
אמצעי הרכבה VECTASHIELD נגד דעיכה	מעבדות וקטוריות	H-1000
דאפי	תרמו פישר סיינטיפיק	62247
רוטור Ti 90	בקמן	לא ישים	רוטור אולטרה-צנטריפוגה
Optima L-90K Ultracentrifuge	בקמן	לא ישים
נוגדן Syn-1, שיבוט 42	BD Biosciences	610786	WB נגד עכבר: 1:5000
נוגדן Syn303	ביולג'נד	824301	נגד עכבר IF: 1:1000
נוגדן טאו	מערכות סינפטיות	314 002	נגד ארנב אם: 1:10,000
נוגדן pser129-αS	מתנה מפוג'יווארה ואחרים, הפניה 19		נגד ארנב WB: 1:5000
נוגדן pser129-αS	אבקאם	dorit_1999	נגד ארנב IF: 1:1000
αS עכבר (D37A6) XP	איתות סלולרי	4179	נגד ארנב IF 1:200
נוגדן אנטי-ארנב מצומד Alexa fluor 555	תרמו פישר סיינטיפיק	A27039
Alexa fluor 488-conjugated anti-mouse anti-mouse antibody	תרמו פישר סיינטיפיק	A-11029
מיקרוסון XL-2000	מיסוניקס		סוניקטור
Ultra Bottles (Oakridge Bottles), PCB, 16x76mm, הרכבה, Noryl Cap, סוג Beckman	שירות המדע האיחוד האירופי	S4484	צינורות אולטרה-צנטריפוגות
AXIO Observer מיקרוסקופ אור הפוך	זיס	לא ישים
מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר TCS SP2	לייקה	לא ישים
מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטי הפוך	ניקון	לא ישים
טריטון x-100	סיגמא-אולדריץ'	X100-500ML	פעילי שטח לא יוניים