מדידת הפעלת קולטן ריח באמצעות בדיקת אדנוזין מונופוספט מחזורית בזמן אמת

תקציר

מקור: Zhang, Y. et al., מדידת תאים חיים של הפעלת קולטן ריח באמצעות בדיקת cAMP בזמן אמת. J. Vis. Exp.(2017)

סרטון זה מדגים את הפרוטוקול למדידת הפעלת קולטן ריח בתאים נגועים באמצעות ביוסנסור מחזורי אדנוזין מונופוספט (cAMP) וזיהוי לומינסנציה. השיטה מיושמת לחקר אינטראקציות קולטן-ליגנד ומסלולי איתות בנוירוני ריח.

פרוטוקול

1. גירוי ומדידת פעילות קולטן ריח (OR) באמצעות בדיקת cAMP בזמן אמת

1. התבוננו בתאים הנגועים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי להבטיח מפגש תקין של 50-80% לכל באר ולחזור לאינקובטור.
2. הכינו את מדיום הגירוי על ידי הוספת 10 mM hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) ו-5 mM glucose לתמיסת המלח המאוזנת של Hank (HBSS).
3. הפשיר את המצע מגיב cAMP בזמן אמת aliquots על קרח. אחסנו מגיב מצע בטמפרטורה של -80°C ב-55 מיקרוליטר לצינור בצינורות תגובת שרשרת פולימראז (PCR). יש להשתמש בשפופרת אחת בכל צלחת.
4. הכן תמיסת שיווי משקל של 2% על ידי ערבוב 55 μL של מגיב המצע ו- 2750 μL HBSS/HEPES/תמיסת גלוקוז.
5. מורחים שכבה עבה של מגבות נייר על הספסל. טפחו בעדינות ושוב ושוב על הצלחת הפוכה על מגבת הנייר, כך שמדיום הטרנספקציה ייספג בה לחלוטין.
6. לשטוף את התאים על ידי pipeting 50 μL של HBSS/HEPES / תמיסת גלוקוז לכל באר.
7. יש להקיש בעדינות ופעם אחר פעם את תמיסת HBSS/HEPES/גלוקוז מהצלחת בעלת 96 הקידוחים.
8. פיפטה 25 μL של 2% שיווי משקל תמיסת לכל באר ודגרה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 2 שעות.
9. הכינו מראש תמיסות ציר ריחות 1M בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) ואחסנו בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
10. לפני תום זמן הדגירה, יש לדלל את תמיסות מלאי הריח לריכוזי עבודה במדיום גירוי הגלוקוז HBSS/HEPES.
    הערה: יש להכפיל את ריכוזי דילולי הריח שהוכנו בשלב זה כדי להניב את הריכוזים הסופיים הנכונים בכל באר.
11. באמצעות קורא לוחות כימילומינסנציה ולפני הוספת ריח, מדדו את רמת ההארה הבסיסית של הצלחת במשך 2 פעמים רצופות בקצב של 1000 מילישניות לבאר.
12. הסר במהירות את הצלחת מקורא הצלחות, הוסף דילול ריח של 25 μL לכל באר, והתחל מיד במדידת הארה רציפה של כל הבארות במשך 20 מחזורים תוך 30 דקות.
    הערה: פיפטה בזהירות כדי למנוע זיהום בארות שכנות בעת שימוש בריחות שונים ו / או ריכוזים שונים של אותם ריחות באותה צלחת.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMSO	סיגמא	D2650
מגיב cAMP GloSensor	פרומגה	E1290
HBSS, עם סידן כלורי ומגנזיום כלורי	גיבקו	14175095
HEPES	היקלון	SH30237
מוסקונה	סנטה קרוז	SC-200528
מאסק טיבטן	סיגמא-אולדריץ'	S359165
PBS, עם סידן או מגנזיום	סלגרו	21-040-CV
צינור PCR 0.2 מ"ל	אקסיגן	PCR-02-C
1.5 מ"ל צינור אפנדורף	אפנדורף
15-מ"ל 17 מ"מ x 120 מ"מ צינור חרוטי	BD בז	352096
פיפטמן רב-ערוצי 8 בארות ו/או 12 בארות	אפנדורף
צלחת תרבית תאים לבנים בעלת תחתית שטוחה 96 בארות	גריינר	655098
צלחת תרבית תאים בגודל 100 מ"מ x 20 מ"מ	BD בז	353003
קורא לוחות F200 אינסופי	טקאן