אפיון חלל חוץ-תאי בפרוסת מוח באמצעות מיקרואלקטרודות יונים סלקטיביות ויונטופורזיס

Abstract

מקור: Odackal, J., et al. יונטופורזיס בזמן אמת עם טטרמתילאמוניום לכימות שבר נפח ועיוות של החלל החוץ תאי במוח. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים כיצד לאפיין את החלל החוץ-תאי בפרוסת מוח באמצעות מיקרואלקטרודות סלקטיביות ויונטופורזיס כדי למדוד ולהשוות אותות חשמליים. תהליך זה מסייע לקבוע את שבר הנפח של החלל ואת מידת הפיתולים.

Protocol

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. יונטופורזיס בזמן אמת בפרוסות מוח

1. הניחו פרוסת מוח בעובי 400 מיקרומטר בתא ההקלטה, וודאו שהיא שקועה במלואה בנוזל המוח השדרתי המלאכותי הזורם (ACSF). מקמו את הפרוסה בעזרת מברשת צבע בצבעי מים והדקו אותה בעדינות בעזרת רשת.
2. העבר הן את מיקרואלקטרודת היונטופורזיס והן את ה- ISM מעל שדה העניין בפרוסת המוח. יש לטבול את שניהם ב-ACSF הזורם אך מעל הפרוסה.
3. קיזוז המתח הן עבור התעלות הייחוס והן עבור ערוצי חישת היונים ל- "0" mV. המתן עד שהמתח בשני הערוצים יתייצב. במקליט התרשימים, סמן את המתח שנמדד בערוץ חישת היונים של ISM. השתמש באפשרות זו כדי לחשב את הפרמטר V הבסיסי ב- Wanda.
4. הניחו את מיקרואלקטרודת ISM והיונטופורזיס בעומק של 200 מיקרומטר בפרוסה ובמרחק של 120 מיקרומטר זו מזו. המתן לייצוב האות לאחר העברת המיקרואלקטרודה לתוך פרוסת המוח.
   הערה: זרם ההטיה המופעל על מיקרואלקטרודת היונטופורזיס גורם להצטברות קטנה של טטרמתילאמוניום (TMA). זוהי טעות נפוצה לקחת הקלטה מוקדם מדי ולהמעיט בהערכת הצטברות האות.
5. במקליט התרשימים, סמן את המתח המיוצב שנמדד בפרוסת המוח בערוץ חישת היונים של ISM. חשב את הפרש המתח בין אות ה- TMA שנמדד בשלב 8.3 לשלב 8.4 והזן ערך זה בשדה "קו בסיס V (mV)" בתיבה אלקטרודת מדידה של ממשק המשתמש הגרפי של Wanda GUI.
6. בצד שמאל של ממשק המשתמש הגרפי, ודא שכל הפרמטרים הניסיוניים נרשמו/הוזנו כראוי. הגדר "בינוני" ל"מוח", "מספר תחבורה" לערך הממוצע המחושב עבור מיקרואלקטרודת היונטופורזיס בשלב 7.4, ו"טמפרטורה" לטמפרטורת האמבטיה המכילה את הפרוסה.
   הערה: יש לרשום V עבור כל קבוצת מדידות. קו הבסיס V יומר על ידי וונדה לפרמטר הבסיס C (mM) (כלומר, ריכוז TMA ברקמת המוח).
7. התחל את ההקלטה על ידי לחיצה על "רכישה" ולאפשר לה לקחת הקלטה מלאה. המתן עד שאות ה- TMA יחזור לקו הבסיס לפני שתרכוש הקלטה חדשה.
8. בצעו שתיים עד שלוש הקלטות רצופות לפני שתוציאו את המיקרואלקטרודות ממיקום המוח שנבחר. הזן את הטמפרטורה שנמדדה בתוכנת Wanda מיד לפני כל הקלטה.
9. הזיזו את שתי המיקרואלקטרודות באלכסון חזרה לפני השטח של הפרוסה. מרימים את שניהם לפחות ל-50 מיקרומטר מעל הפרוסה. באמצעות מקליט התרשימים, קבע כל שינוי בין ה- V הנמדד כעת לבין מדידתו משלב 8.3.
10. מרכזו את קצות ה-ISM והמיקרואלקטרודות היונטופורטיות ביחס זו לזו בצירי x, y ו-z. השג שינויי ריווח, אם קיימים, מהתצוגה של תיבת הבקרה micromanipulator.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מגבר עבור ISM	דגן	דגם IX2-700 קדם-מגבר תוך-תאי כפול	מגבר יון ומתח ייחוס עם N=0.1 (עבור קנה ייחוס) ו-N=0.001 (עבור קנה יונים)
מיסקוסקופ תרכובת ביולוגית (עם מטרה 4x ו-10x)			לחיתוך קצות המיקרואלקטרודות ולבדיקת מיקרואלקטרודות; ספקים שונים, כגון AmScope
צינורות זכוכית נימים בורוסיליקט תטא	מכשיר הרווארד	וורנר אינסטרומנטס דגם TG200-4; הזמנה #64-0811	צינורות זכוכית בעלי קנה כפול עבור מיקרואלקטרודות סלקטיביות של יונים ומיקרואלקטרודות יונטופורטיות; קוטר חיצוני 2.0 מ"מ, ת.ז. 1.4 מ"מ, מחיצה 0.2 מ"מ, אורך 10 ס"מ
מקליט תרשימים			להקליט מתחים רציפים על מיקרואלקטרודה סלקטיבית של יונים במהלך כיול בתקני טטרמתילאמוניום ובמהלך ניסוי RTI; לדוגמה, תרשים דו-תעלות מסוג Kipp & Zonen BD112 מוקלט, זמין משופץ
תוכנה מסחרית	ה-MathWorks	MATLAB, ארגז כלים לרכישת נתונים	לרכישת נתונים וניתוחם באמצעות תוכניות Wanda ו-Walter. שים לב כי רישיון אקדמי זמין.
משקפי מגן לעיניים	פישר
מיקרוסקופ מורכב בשלב קבוע	אולימפוס	BX51WI	יכול להשתמש במיקרוסקופים מורכבים אחרים עם שלבים קבועים
מלקחיים	כלים מדעיים משובחים	#11251-10	כדי לסדוק נימי זכוכית; Dumond #5, רצוי בשימוש ולא נחוץ יותר לעבודה משובחת
יחידה יונטופורטית	דגן	ION-100 ו-PS-100	ION-100 היא יחידת יונטופורזיס חד-ערוצית +/- תאימות ל-130 וולט; PS-100 הוא ספק כוח חיצוני; חלופות: למשל Axoprobe-1A מתוצרת Axon Instruments (כיום Molecular Devices), מחוץ לייצור, לבדוק זמינות של יחידות מחודשות (eBay ואתרים אחרים)
מחזיק מיקרואלקטרודות	WPI	M3301EH	להחזיק מיקרואלטרוד סלקטיבי יונים טרומי לסילניזציה ומילוי קצה חבית סלקטיבית יונים במחליף יונים נוזלי; WPI מוכרת שתי גרסאות של מחזיק זה, Clear M3301EH ו-Black M3301EH. מניסיוננו, M3301EH הצלול נראה קשיח יותר מהשחור M3301EH.
מיקרומניפולטור	נארישיגה	מ"מ-3	למקם מיקרואלקטרודה סלקטיבית יונים טרומית במהלך סילניזציה ומילוי קצה חבית סלקטיבית יונים עם מחליף יונים נוזלי; ניתן להחליף עם כל מיקרומניפולטור שלושה צירים במצב עבודה טוב
אובייקטיבי 5x יבש	אולימפוס	MPlan N
Objective 10x טבילה במים	אולימפוס	UMPlan FL N	יעד 10x הוא טבילה במים, צמצם מספרי הוא 0.3, מרחק עבודה הוא 3.3 מ"מ
פלטפורמה ושלב תרגום X-Y למיקרוסקופ שלב קבוע	אקספו	גיברלטר ברלי	הפלטפורמה מחזיקה תא פרוסה, מיקרומניפולטורים ואקססוריות, שלב תרגום X-Y נע במיקרוסקופ מבלי לפגוע ביציבות ההקלטה
מיקרומניפולטור רובוטי עם מיקום מדויק x,y,z	סאטר אינסטרומנטס	MP-285	יש צורך בשני מירקומאניפולטורים כדי להחזיק בנפרד מיקרואלקטרודה סלקטיבית יונים ומיקרואלקטרודה יונטופורטית. ניתן גם להדביק מיקרופיפטות במערך מרווח (ראה טקסט).
יחידת מיזוג אותות עם מסנן במעבר נמוך	מכשירי אקסון	CyberAmp 320 או 380	אינו זמין עוד מהיצרן אך עשוי להיות זמין מ- E-Bay; חלופות: למשל מסנן/מגבר FLA-01 מבית Cygnus Technology. זהו מכשיר חד-ערוצי עם חיתוך מינימלי של 10 הרץ באמצעות מסנן בסל רב-קוטבי, אך ייתכן שהחברה תהיה מוכנה לשנות אותו לתדר חיתוך נמוך יותר (2 הרץ) במידת הצורך.
חוט כסף	מערכות A-M	#7830	קוטר 0.015 אינץ', חשוף (ללא ציפוי)
תא פרוסה	מכשיר הרווארד	וורנר דגם RC-27L	זהו תא פרוסה טבילה; אין להשתמש בתא פרוסות ממשק
סטריאומיקרוסקופ			עבור silanization ומילוי קצה של חבית יון סלקטיבי עם מחליף יונים נוזלי; רכוב אופקית; ספקים שונים
טטרמתימוניום (TMA) כלוריד	סיגמא-אולדריץ'	T-3411	פתרון 5 מ '; אזהרה: רעילות חריפה (דרך הפה, עור, שאיפה), קרצינוגניות, מסוכנת לסביבה המימית, ראה מידע בטיחות Sigma-Aldrich לתיאור מלא