ביסוס מודל חולדות למחלת אלצהיימר באמצעות הזרקת פפטיד עמילואיד-בטא

תקציר

מקור: Xiaoguang, W., et al. הקמת חיקוי רב ערך של מחלת אלצהיימר במודל של חיות חולדה על ידי הזרקה תוך-מוחית של חלבון עמילואיד-בטא מורכב. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים את ההליך להזרקת פפטידים עמילואיד-בטא, אלומיניום כלורי וגורם גדילה נוירו-דלקתי, אשר ביחד מסייע בהיווצרות רובד עמילואיד רעיל באזור ההיפוקמפוס. זה גורם לפגיעה בזיכרון בחולדה, האופיינית למחלת אלצהיימר.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הליך כירורגי

הערה: 20 חולדות Sprague-Dawley זכרים הוזרקו במיקרו עם חלבון עמילואיד-בטא מורכב (Aβ) לחדר הלטרלי ולגרעין התלאמי האנטרודורסלי והוגדרו כקבוצה שטופלה ב-Aβ. 20 חולדות נוספות עברו את אותו ניתוח אך קיבלו 0.1% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) מיקרו-הזרקה במי מלח והוגדרו כקבוצה המופעלת על ידי דמה.

1. מרדימים את החולדות עם 100% איזופלורן על ידי שאיפה, ואז מרסנים אותן על מנגנון סטריאוטקסי במוח.
2. לגלח את הפרווה על קודקוד הראש עם מספריים כירורגיים ולחטא עם יודופור. לאחר מכן, לכסות מגבת כירורגית חד פעמית על הראש.
3. בצע חתך על עור הראש לאורך calvaria אורכי החציוני עם bistouries כירורגי מספריים.
4. מפרידים את הרקמה התת עורית ואת הפאשיה, מנגבים את קלבריום הגולגולת בכותנה יבשה סטרילית כדי לעצור את הדימום, ומסמנים את הברגמה בעט טוש.
5. עיין במפה הסטריאוטקסית של מוח החולדה בהתחשב בברגמה כנקודת המוצא, סמן את שלוש הנקודות, הגרעין התלמי האנטרודורסלי (AD) (אחורי (P): 2.0 מ"מ לברגמה; לטרלי (L): 1.4 מ"מ לקו האמצע) להזרקת גורם גדילה טרנספורמטיבי אנושי רקומביננטי-β1 (RHTGF-β1) וקיבוע בורג אחד, אזור החדר הצידי (LV) (אחורי (P): 0.8 מ"מ לברגמה; רוחבי (L): 2.0 מ"מ לקו האמצע) להזרקת חלבון עמילואיד-בטא 25-35 (Aβ25-35) ואלומיניום טריכלוריד (AlCl₃), ומקום קיבוע הבורג השני (קדמי (F): 2.0 מ"מ לברגמה; רוחבי (L): 1.5 מ"מ לקו האמצע).
6. קודחים בעדינות שלושה חורים בקוטר 1 מ"מ עם מקדח עצם גמיש המיועד בשלוש הנקודות הנ"ל של הגולגולת (1.5 מדרגה). אין להבריג עמוק יותר מהנדרש כדי למנוע דקירה של רקמת המוח.
7. עצור את הדימום ונקה את פני הגולגולת שוב ושוב עם כותנה יבשה סטרילית.
8. הכנס מחט המחוברת למשאבת המיקרו-הזרקה למוח בעומק 4.6 מ"מ והזריק בעדינות 1 μL RHTGF-β1 (10 ננוגרם) לאזור המודעה. הישאר את המחט במשך 2 דקות לאחר ההזרקה ולשלוף לאט את המחט.
9. מקבעים את שני הברגים לתוך הגולגולת, המסומנים בנקודות המודעה, ואת מקום קיבוע הבורג השני של הגולגולת (שנקבע במדרגה 1.5) בעזרת מברג קטן. אין להבריג עמוק יותר מהנדרש כדי למנוע דקירה של רקמת המוח.
10. מרכיבים את מערכת השתלת הצינורית ומחדירים את צינורית הדמה לצינורית המנחה לאחר חיטוי בלחץ גבוה.
11. הכניסו את צינורית מדריך הנירוסטה למוח בקוטר 4.6 מ"מ לאזור ה-LV דרך חור הגולגולת בעזרת בעל הצינורית של המנגנון הסטריאוטקסי של החולדות.
12. מערבבים את חומר הבסיס התותב עם מי בסיס תותבים ביחס של 1.5 גרם ל -1 מ"ל, מניחים את העיסה כדי לכסות את כן הפלסטיק של צינורית המנחה, ושני ברגים כדי לשתק את צינורית ההנחיה ומכסים את כל חתך העור כדי למנוע זיהום בעור.
13. ביום השני לניתוח הורדמו החולדות בשאיפת איזופלורן באמצעות מכונת הרדמה של בעלי חיים קטנים. מוציאים את צינורית הדמה, מכניסים את הצינורית הפנימית לתוך הצינורית המנחה, ומבריגי את בורג הקיבוע כדי לשתק את הצינורית הפנימית.
14. הגדר את צינור הפוליאתילן המקשר בין משאבת המיקרו-הזרקה לצינורית הפנימית ומווסת את מהירות ההזרקה ל- 1 μL/min. הזריק במיקרו את Aβ25-35 או AlCl₃ ל- LV.
15. הזרקה זעירה של 4 מיקרוגרם (1 μL) Aβ25-35 מדי יום במשך 14 ימים בבוקר ו-3 מיקרוליטר AlCl₃ (1%) מדי יום במשך 5 ימים אחר הצהריים תחת הרדמה איזופלורנית.
16. ממתינים 5 דקות לאחר סיום ההזרקה, מוציאים בעדינות את הצינורית הפנימית ומחדירים שוב את צינורית הדמה לתוך צינורית המנחה.
17. ביום ה-15, לאחר הניתוח (המתאים ליום ההזרקה האחרון של Aβ25-35), יש לפרק את מערכת השתלת הצינורית. הסירו בעדינות את חומר הבסיס התותב המוצק בעזרת מספריים ומלקחיים כירורגיים, פתחו את שני הברגים, שלפו את צינורית ההנחיה וחיטאו את הפצע בבטדין. ממלאים את חור הגולגולת במלט עצם ותופרים את העור בשיטת תפר קטועה פשוטה.
18. בצע את אותה פעולה עם הקבוצה המופעלת על ידי דמה והזריק מיקרו-הזרקה של 0.1% מי מלח DMSO.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
עכברוש ספראג-דולי	בייג'ינג ויטל נהר מעבדה בעלי חיים טכנולוגיה ושות', בע"מ, סין	SCXK (ג'ינג) 2012-0001	300–350 גרם
הרדמה ניידת של בעלי חיים קטנים	RWD מדעי החיים ושות', בע מ סין	₪140
מנגנון סטריאוטקסי במוח	RWD מדעי החיים ושות', בע מ סין	68001
מקדח עצם גמיש	שנגחאי רך ארוך טכנולוגיה פיתוח ושות', בע מ סין	BW-SD908
מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת	יפן ושות', בע ' מ יפן	JEM-1400
משאבת מיקרו-הזרקה דו-ערוצית	RWD מדעי החיים ושות', בע מ סין	RWD202
מיקרוטום EM	Hitachi ושות', בע ' מ סין	H-7650
צינורית דמה	RWD מדעי החיים ושות', בע מ סין	62001	0.D.0.64×I.D.0.0.45mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html
צינורית מדריך	RWD מדעי החיים ושות', בע מ סין	62101	0.D.0.40 מ"מ/מ"ק
צינורית פנימית	RWD מדעי החיים ושות', בע מ סין	62201	0.D.0.41×I.D.0.25 מ"מ/M3.5
מהדקים את האגוז	RWD מדעי החיים ושות', בע מ סין	62501	0.D.5.5 מ"מ/L7.5 מ"מ/M3.5
תיקון בורג	RWD מדעי החיים ושות', בע מ סין	62514	M1.2×L2.0 מ"מ (100BAO)
המברג	RWD מדעי החיים ושות', בע מ סין	62999	45*1 מ"מ
צינורות PE	RWD מדעי החיים ושות', בע מ סין	62302
עמילואיד בטא 25-35	סיגמא אולדריץ' ושות' ארה"ב	SCP0002-5 מ"ג
גורם גדילה טרנספורמטיבי אנושי רקומביננטי-β1	PeproTech Inc. ארה"ב	100-21
אלומיניום טריכלוריד	טיינג'ין Kemiou כימית מגיב ושות', בע מ סין	3011080
אבץ פוספט צמנט דנטלי	חומר דנטלי של מפעל שנגחאי מכשירים רפואיים ושות', בע"מ סין	201311