כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
C57BL/6 (H-2b) נקבות עכברים, בנות 8 שבועות, נרכשו ועכברי C57BL/6 AQP4-/- סופקו על ידי א. ורקמן.
1. חיסון עכברים בפפטידים מסוג AQP4
- הכינו מלאי עבודה מלא של האדג'ובנט (CFA) של פרוינד.
- לטחון דק תכשיר מיובש של Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) באמצעות מכתש ו pestle.
- הוסף H37Ra טחון לאדג'ובנט לא שלם של פרוינד לריכוז סופי של 4 מ"ג/מ"ל. CFA ניתן לאחסן ב 4 ° C עד 6 חודשים.
- להמיס אנטיגן ליופילי (Ag) פפטיד AQP4 במי מלח חוצצים פוספט (PBS) לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל. יש לשמור על טמפרטורה של 4°C או על קרח.
- הכינו הרכבה של 2 מזרקי luer-lock, מחוברים עם סטופק, המכיל תחליב CFA/פפטידי.
- חברו מזרק נעילה מזכוכית ללא בוכנה לסטופקוק ניילון תלת-כיווני עם 2 חיבורי נעילת פיתוי זכריים. סגור את הסטופקוק על ידי סיבוב הידית לכיוון המזרק. מקם את הקצה הפתוח של המזרק כלפי מעלה, ומאפשר למזרק לשמש כמבחנה. הניחו אותו במדף צינורות ליציבות נוספת.
- וורטקס, מלאי העבודה CFA ופתרון Ag. הוסף נפח 1:1 של פפטיד / CFA למזרק הפתוח. 200 μL של CFA/Ag (4 x 50 μL) נדרש לכל עכבר.
הערה: בדרך כלל, כ 1 מ"ל של הכנה הוא איבד את stopcock, אשר יפחית את הסכום הזמין לחיסון. לכן, חשוב לשלב זאת בחישוב הנפח הכולל הנדרש.
דוגמה: עבור חיסון של 5 עכברים: (200 מיקרוליטר / חיה x 5 בעלי חיים) + 1 מ"ל נפח נוסף = 2 מ"ל סה"כ CFA/Ag נדרש.
- הכנס את בונת הזכוכית לתוך המזרק ותוך כדי החזקתו במקומו, הפוך את המזרק כך שהסטופרקוק מכוון כלפי מעלה. החלף את ידית הסטופר לחיבור הנשי שאינו בשימוש. בזהירות להפעיל לחץ על בוכנה זכוכית על מנת להסיר אוויר עודף מן המזרק. הנוזל ממלא את חיבור הפיתוי-נעילה הגברי השני של הסטופקוק.
- חברו מזרק זכוכית שני (הבוכנה מוכנסת במלואה) לחיבור הפיתוי-נעילה הגברי השני של הסטופקוק. זו צריכה להיות מערכת סגורה של 2 מזרקי זכוכית המחוברים לסטופקוק המכיל כמה שפחות אוויר עודף.
- ליצירת תחליב, מערבבים על ידי דחיפת הבוכנות להעביר את הנוזל לסירוגין בין 2 המזרקים למשך כ-2 דקות. מצננים את המזרקים על קרח כ-10 דקות. חוזרים על הקירור והערבוב עד לשינוי ברור בצמיגות התכשיר, והתוצאה היא תחליב לבן ונוקשה מאוד. מקררים את המזרקים המכילים את התחליב ב-4°C או שומרים על קרח.
- מעבירים את כל התחליב למזרק זכוכית אחד, מוציאים את מזרק הזכוכית הריק ומחליפים אותו במזרק 1 מ"ל להזרקה. ממלאים את המזרק החדש בתחליב, מוציאים אותו מהסטופרקוק ומחברים מחט (25G x 5/8).
- "בדיקת מים" את האמולסיה לעקביות. לגרש טיפה של תחליב לתוך צלחת קטנה של מים. התחליב לא צריך להתפזר, מה שמעיד על כך שהוא מתאים להזרקה.
- אם התחליב מתפזר, הוא אינו מוכן להזרקה; מעבירים את הנוזל בחזרה למזרקי הזכוכית וממשיכים לערבב ואז מצננים שוב עד שהתחליב נוקשה.
- בדוק שוב את האמולסיה עד להשגת העקביות הנכונה.
- הזריקו לתורם AQP4-/- עכברים תת עורית (s.c.) תחליב המכיל את פפטיד AQP4. כל עכבר מקבל 4 x 50 μL s.c. זריקות (200 μL סה"כ (100 מיקרוגרם פפטיד)). ארבעת האתרים כוללים את שני צידי הבטן התחתונה, המתנקזים לבלוטות הלימפה המפשעות (LN), ואת שני צידי דופן בית החזה מדיאלי לכל בית שחי, המתנקזים ל- LN בבית השחי. ההעברה המאומצת תדרוש 1-2 עכברים תורמים מחוסנים לכל עכבר מקבל.
2. תרבית תאי T וקיטוב תאי T פרו-דלקתיים
- 10-12 ימים לאחר החיסון, לאסוף LN מן העכברים.
- במגש קרח, הכינו צלחות פטרי בקוטר 60 מ"מ המצוידות במסננת תאים (גודל רשת 70 מיקרומטר) ומכילות מדיה מצוננת של מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) עם 10% סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS) ו-100 U/mL פניצילין-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (pen-strep) (RFPS).
- המתת חסד של עכברים על ידי חשיפה ל-CO2, ולאחר מכן פריקת צוואר הרחם. טבלו עכברים באתנול 70% ולאחר מכן הצמידו כל משטח כף רגל ללוח נתיחה.
- חתכו חתך עור בקו האמצע מהמפשעה לצוואר ובמורד כל רגל. משכו את העור מהצפק והצמידו אותו בחוזקה ללוח. מנתחים LN מפשעתי ובית השחי ומניחים בצלוחית פטרי המכילה RFPS, על קרח.
- לניסויי העברה מאומצת, שלבו LN מכל בעלי החיים באותה קבוצת חיסון. לניתוחים ציטומטריים של זרימה של שימוש ב-Vβ, יש להפריד בין LN לבעלי חיים בודדים.
- הניחו את מסננת התא המכילה את ה-LN על צינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל המכיל RFPS. השתמש בקצה השטוח של בוכנה מזרק סטרילי 5 מ"ל כדי ללחוץ על תאי LN דרך המסננת, שטיפה עם 20-30 מ"ל של RFPS כדי להקל על התאוששות התאים. שמור על תאי LN על קרח לאורך כל העיבוד עד זמן לתרבית.
- לשטוף פעמיים, צנטריפוגה ב 393 x גרם במשך 5 דקות. לאחר השטיפה השנייה, השהה מחדש את תאי LN במדיה של תאי T (TCM). TCM מכיל RPMI עם 10% FBS מומת חום, 292 מיקרוגרם/מ"ל L-גלוטמין, 110 מיקרוגרם/מ"ל נתרן פירובט, ו-55 מיקרומטר 2-מרקפטואתנול ופן-סטרפטוקו. בדרך כלל, נפח של 5 מ"ל TCM לכל עכבר תורם משמש.
- ספור את תאי LN. התשואה הצפויה היא כ-3-6 x 107 תאי LN לכל תורם עכבר מחוסן.
- להקים תרבויות מקטבות לטרנספר מאומץ.
- הכינו תרבית מקטבת Th17 של 5 x 106 תאי LN למ"ל עם 10 מיקרוגרם/מ"ל Ag, 20 ng/mL עכבר רקומביננטי אינטרלוקין (IL)-23 ועכבר רקומביננטי 10 ng/mL IL-6 ב-TCM.
- לחלופין, עבור קיטוב Th1, להכין תרבית של 5 x 106 תאי LN לכל מ"ל עם 10 מיקרוגרם / מ"ל Ag ועכבר רקומביננטי 10 ng / mL IL-12 ב TCM.
- מוסיפים 2 מ"ל (1 x 10 7 תאים) לכל באר מתערובת התרבית המקטבת לצלחת בת 12 בארות. תאי LN מ-2-4 עכברים תורמים ימלאו צלחת אחת בת 12 בארות. שמור על תרביות באינקובטור לח ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 72 שעות.
- בדוק חזותית את תאי LN בתרבית להפעלה ב 48 שעות ו 72 שעות. תאים פעילים ייצרו אשכולות נרחבים ותאי T יגדלו בגודלם, ויהפכו לפלאומורפיים יותר. העלייה בחילוף החומרים תגרום להורדת ה- pH בתקשורת, שינוי מאפרסק לכתום. אם ה- pH נמוך מספיק כדי להפוך את המדיה לצהובה, הוסף 1 מ"ל של TCM טרי כדי למנוע רעילות לתאים ב -24 השעות הנותרות.
- המשך להעברה מאומצת.
3. העברה מאמצת של תאי T פתוגניים ספציפיים ל-AQP4
הערה: שלב זה נובע מסעיף 2.5: תרבית תאי T וקיטוב תאי T פרו-דלקתיים.
- לשחזר תאים מקוטבים מ 12 צלחות באר על ידי pipeting למעלה ולמטה כדי לעקור, ולהעביר אותם צינור 50 מ"ל. יש לשמור על קרח עד לזריקות.
- ספרו את התאים, שטפו אותם פעמיים ב-PBS קר, והכינו תרחיף של 1 x 108 תאים/מ"ל ב-PBS. בדרך כלל, להזריק תאים בתוך שעה.
- מערבבים בעדינות את התאים על ידי ערבול אותם ומעבירים אותם מזרק 1 מ"ל בזמן ההזרקה. יש לתת 200 μL של התאים (2 x 107) תוך ורידי (i.v.) לכל עכבר, דרך וריד הזנב.
- הזריקו לכל עכבר מושתל 200 ננוגרם של רעלן B. pertussis מדולל ב-200 μL של PBS באותו יום ויומיים לאחר מכן. עקוב אחר עכברים מדי יום לאיתור סימנים של מחלה קלינית.
