צביעה אימונופלואורסצנטית של אוכלוסיות נוירונים במערכת העיכול העוברית

תקציר

מקור: Barlow-Anacker, A. J., et al., Immunostaining כדי לדמיין התפתחות מערכת העצבים האנטרית של מורין. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים את ההכתמה החיסונית של מערכת העיכול העוברית של מורין כדי לדמיין ולנתח את התפלגות האוכלוסייה העצבית באמצעות immunofluorescence ומיקרוסקופ קונפוקלי.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. פרוטוקול חיסוני

1. אם הדגימות אוחסנו ב-30% סוכרוז, שטפו אותן 3 פעמים במשך 20 דקות ב-PBS אחד על משטח נדנדה.
2. מקם את דרכי העיכול בתמיסת החסימה על משטח נדנדה למשך שעה אחת ב- RT.
3. הסר את תמיסת החסימה ודגר על דרכי העיכול עם הכמות המתאימה של נוגדנים ראשוניים המדוללים בתמיסת החסימה למשך 4 שעות ב- RT או O/N ב- 4 ° C על פלטפורמת נדנדה. השתמש בדילול 1:1,000 של נוגדן אנטי-הו אנושי (סרום שהתקבל מהמטופל), דילול 1:1,000 של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) של עוף, ודילול 1:100 של נוגדן אנטי-ChAT עיזים.
   הערה: אנו משתמשים בנוגדן אנטי-הו אנושי שהתקבל באופן מקומי ממטופל; עם זאת, נוגדנים נגד Hu זמינים מסחרית, למשל, עכבר anti-Hu (להשתמש בדילול 1:500).
4. שטפו את מערכת העיכול ב-1x PBS 3 פעמים במשך 5 דקות ולאחר מכן במשך שעה אחת ב-RT על משטח נדנדה.
5. החלף את PBS 1x בנוגדנים משניים מדוללים 1:500 בתמיסת חסימה על פלטפורמת נדנדה למשך 4 שעות ב- RT או O/N ב- 4 ° C. השתמש בצבע תגובתי לחמור אנטי אנושי אמין כגון Dylight, חמור נגד עוף Cy2 וחמור נגד עז Cy5. אם אתה משתמש בנוגדן אנטי-הו של עכבר, השתמש בדילול של 1:500 של חמור אנטי-עכבר אמין תגובתי צבע 405.
   הערה: עוצמת הביטוי האנדוגני של GFP ו- tdTomato וצלילות ההכתמה החיסונית עולים עם הגיל ההתפתחותי. בדרך כלל אנו מבצעים חיסונים למעיים עובריים בנפרד בצינורות של 0.2 מ"ל עם תמיסת צביעה של 150 מיקרוליטר על מנת להפחית את נפח הנוגדנים בהם נעשה שימוש וגם כדי להבטיח צביעה יעילה של הרקמה.
6. שטפו את מערכת העיכול ב-1x PBS 3 פעמים במשך 5 דקות ולאחר מכן במשך שעה אחת ב-RT על משטח נדנדה.
7. הניחו כמה טיפות של מדיום הרכבה פלואורסצנטי עם DAPI על מגלשת זכוכית. יש לטבול את מערכת העיכול בתווך ההרכבה הפלואורסצנטי ולהוסיף כיסוי ישירות על גבי הרקמה. מדיום ההרכבה הפלואורסצנטי -G הוא תרכובת מסיסה במים המספקת חותם קבוע למחצה.
   הערה: השתמש באמצעי הרכבה פלואורסצנטי כגון Vectashield, אמצעי הרכבה מבוסס גליצרול המונע דהיית נוגדנים והלבנה. שני מוצרים אלה מאפשרים לאחסן רקמות לפרקי זמן ארוכים ב 4 ° C.
8. צלם תמונות של כל פלואורופור באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. השתמש באורכי גל העירור עבור פלואורופורים ומסננים המשמשים בטבלה 1.
9. בצע ניתוח תמונה בעזרת מחשב באמצעות תוכנה מתאימה בהתאם לסוג הקונפוקל המשמש ללכידת תמונות.

טבלה 1: אורכי גל של עירור הדמיה קונפוקלית, פלואורופורים ומסננים. אורכי גל העירור, פלואורופורים הניתנים לגילוי והמסננים המשמשים מוצגים. מידע זה יכול לשמש בבחירת שילובים של נוגדנים משניים עבור immunofluoresence צבעוני.

עירור			פליטה
קו לייזר	סוג פלואורופור	דוגמאות	צינור מכפיל תמונה	אפשרויות סינון
408 נאנומטר	כחול	Alexa Fluor 405, Cascade Blue, Coumarin 30, DAPI, Hoechst, Pacific Blue, רוב הנקודות הקוונטיות	1	BP 425-475 ננומטר
488 ניוטון מטר	ירוק	Alexa Fluor 488, ATTO 488, Calcein, Cy2, eGFP, FITC, אורגון גרין, YO-PRO-1	2	BP 500-550 ננומטר
561 ניוטון מטר	אדום	Alexa Fluor 546, 555, 568 ו-594, Cy3, DiI, DsRed, mCherry, Phycoerythrin (PE), Propidium Iodine (PI), RFP, TAMRA, tdTomato, TRITC	3	BP 570-620 ננומטר
638 ניוטון מטר	אדום רחוק	Alexa Fluor 633 ו-647, Allophycocyanin (APC), Cy5, TO-PRO-3	4	BP 663-738 ננומטר

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פוספט חוצץ מלוחים	אוקסואיד	BR0014G
אלבומין בסרום בקר	פישר	BP1605
טריטון X-100	סיגמא	X100
היקף פלואורסצנטי	ניקון	סטריאוסקופ SMZ-18
1.5 מ"ל צינורות אפנדורף	VWR	20170-038
פלואורומאונט-G	SouthernBiotech , בירמינגהם, אלבמה	0100-01
שקופיות זכוכית	פישר	12-550-15
כיסוי זכוכית	VWR	16004-330
מיקרוסקופ קונפוקלי	ניקון	ניקון A1
Nikon Elements	ניקון