השראת דלקת עצבית בעכברים באמצעות הזרקת סיבי אלפא-סינוקלאין

תקציר

מקור: Breid, S. et al. Bioluminescence: הדמיה של דלקת עצבית בעכברים טרנסגניים לאחר חיסון היקפי של סיבי אלפא-סינוקלאין. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים הזרקה של סיבי אלפא-סינוקלאין לעכבר כדי לגרום לדלקת עצבית. הסיבים מוזרקים תוך צפקית לעכבר מהונדס המבטא חלבוני אלפא-סינוקלאין שעברו מוטציה. עם הגעתם למערכת העצבים המרכזית, הסיבים נכנסים לנוירונים וגורמים לצבירה של החלבונים שעברו מוטציה. הצברים התפשטו לתאי עצב שכנים, מיקרוגליה ואסטרוציטים. זיהוי הצברים מעורר תאי מיקרוגליה לגרום לדלקת עצבית, ולפגוע בנוירונים.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. מודל בעלי חיים

1. Intercross hemizygous Tg (Gfap-luc^+/-) עכברים (עכברים טרנסגניים המבטאים לוציפראז גחליליות) עם עכברי Tg המיזיגוטיים (M83^+/-) (עכברים טרנסגניים המבטאים אלפא-סינוקלאין אנושי עם מוטציית A53T המשפחתית) ליצירת עכברי Tg (M83^+/-:Gfap-luc^+/-) המיזיגוטיים.
2. גנוטיפ הצאצא עם תגובת שרשרת פוליאמראז בזמן אמת (PCR) לנוכחות הטרנסגן המקודד אלפא-סינוקלאין אנושי ועם PCR סטנדרטי עבור לוציפראז גחליליות.
3. לחסן את בעלי החיים בגיל שישה עד שמונה שבועות.

2. הכנת החיסון

1. הכינו אלפא-סינוקלאין אנושי רקומביננטי מונומרי עם מוטציית A53T במאגר מלח חוצץ טריס (TBS) המכיל 150 mM NaCl ב-20 מילימטר Tris-HCl (pH 7.2).
2. הכינו אלפא-סינוקלאין פיברילרי לחיסונים על ידי התססת 3 מיקרוגרם/מיקרוליטר של אלפא-סינוקלאין אנושי רקומביננטי מונומרי בשייקר אורביטלי ב-800 סל"ד ו-37°C למשך 5 ימים.
3. יש לדלל מכלולים פיבריליים במי מלח חוצצי פוספט (PBS) כדי להגיע לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/μL עבור חיסונים תוך צפקיים.
4. שברו את סיבי האלפא-סינוקלאין בעזרת סוניק מוט למשך דקה אחת (40 פעימות של 0.5 שניות עם הפסקה של שנייה אחת בין כל פולס ומשרעת שנקבעה ל-50%) על קרח. כדי למנוע זיהום על ידי זריעה צולבת, השתמש בבדיקות סוניקציה נקיות כדי להכין חיסונים שונים.

3. זריקות תוך צפקיות

1. לזריקות תוך פריטוניאליות, נרקוט את בעלי החיים זמן קצר בתא הרדמה על ידי שאיפה עם איזופלורן/חמצן באמצעות קצב זרימה של 2 ליטר/דקה והוופורייזר מכוון ל-2%. צבטו את הבוהן של בעל החיים וודאו שהוא אינו מושך את הגפה האחורית שלו כדי להבטיח הרדמה נאותה.
2. מלאו מזרק היפודרמי חד פעמי 27 גרם ב-50 מיקרוליטר סיבי אלפא-סינוקלאין או PBS.
3. יש להזריק ישירות לצפק העכבר ולהימנע מחדירה למעי הדק או לצקום הממוקם מאחורי דופן הבטן על ידי החזקת בעל החיים בתנוחה גבית כאשר ראשו פונה הרחק מהחוקר וכלפי מטה בטמפרטורה של כ-45 מעלות. עקוב אחר בעלי חיים עד שהם התאוששו מההרדמה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מלח חוצץ פוספט (PBS)	Invitrogen	14190169
מזרק 27 מד	VWR	613-4900
איזופלורן	Piramal שירותי בריאות	PZN 4831850
Sonopuls Mini20 sonicator	בנדלין	3648
Tg (M83+/-) עכברים או B6; עכברי C3-Tg(PrnpSNCA*A53T)83Vle/J	מעבדת ג'קסון	4479