הדמיה בהילוך מהיר לניטור ההתפשטות הטרנסתאית של חלבונים דמויי פריונים בנמטודות טרנסגניות

תקציר

מקור: Nussbaum-Krammer, C. I., et al. חקירת ההתפשטות והרעילות של חלבונים דמויי פריונים באמצעות אורגניזם המודל Metazoan C. elegans. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים את ההליך להדמיית in vivo של C. elegans המבטאים חלבונים דמויי פריונים המתויגים בחלבון פלואורסצנטי אדום. הפרוטוקול כולל השתקת נמטודות על משטח אגרוז למיקרוסקופ קונפוקלי בהילוך מהיר, החושף צבירה והובלה של חלבונים בתוך ובין תאים. טכניקה זו חיונית לחקר צבירת חלבונים הקשורים למחלות נוירודגנרטיביות.

פרוטוקול

1. ניטור התפשטות טרנס-תאית של חלבונים דמויי פריון על ידי In Vivo דימות בהילוך מהיר

הערה: לגדל C. elegans סוג בר (WT) (N2) וקווים טרנסגניים על פי שיטות סטנדרטיות ולשלוט בזהירות על טמפרטורת הגידול.

1. יצירת קווים טרנסגניים של C. elegans המבטאים את החלבון דמוי הפריון, המתויגים בחלבון פלואורסצנטי אדום מונומרי (mRFP).
2. הכנת אוכלוסיות מסונכרנות על ידי הטלת ביצים או הלבנה בשיטות סטנדרטיות.
   1. סנכרון באמצעות הטלת ביצים
      1. מעבירים 10 - 20 מבוגרים גרביד על צלחת ונותנים להם להטיל ביצים במשך 1 - 2 שעות. הוציאו את הבוגרים מהצלחת ותנו לצאצאים לגדול עד לגיל הרצוי.
   2. סנכרון באמצעות הלבנה
      1. לאסוף אוכלוסייה לא מסונכרנת של מבוגרים גרבידים ולהלבין אותם בתמיסת היפוכלוריט אלקליין (250 מילימטר נתרן הידרוקסידי (NaOH) ודילול 1:4 (v/v) של אקונומיקה מסחרית במים (H₂O)). יש לשטוף את הביצים פעמיים (218 x גרם למשך דקה) עם מאגר M9 (21 mM Na₂HPO₄·7H₂O (די-נתרן מימן פוספט heptahydrate), 22 mM (אשלגן דימימן פוספט) KH₂PO₄, 86 mM נתרן כלורי (NaCl), 1 mM MgSO₄·7H₂O (מגנזיום גופרתי heptahydrate), להוסיף dH₂O עד 1 L).
      2. אפשרו להם לבקוע בחיץ M9 עם תסיסה עדינה למשך הלילה (O/N) בטמפרטורה של 20°C. התפתחות התולעים תיעצר בשלב L1 בהיעדר מקור מזון, ותשאיר אוכלוסייה מסונכרנת. העבירו L1s על צלחות Nematode Growth Media (NGM) טריות שנזרעו עם חיידקי OP50 E. coli ותנו לצאצאים להתפתח עד לגיל הרצוי.
3. הכינו רפידות אגרוז 2% (ב-H₂O) על שקופית מיקרוסקופ כמתואר.
   1. הכינו שתי שקופיות מיקרוסקופ עם סרט תיוג מונח לכל אורכן כדי שישמשו כספייסרים. הניחו ביניהם מגלשת מיקרוסקופ שלישית.
   2. ממיסים 2% אגרוז ב-H₂O ופיפטה טיפה אחת על המגלשה הנקייה.
   3. הניחו שקופית רביעית בניצב לשלוש המגלשות האחרות על גבי טיפת האגר. לחץ בעדינות כלפי מטה כדי לשטח את הפד לעובי זהה לזה של סרט התיוג.
   4. הניחו לו להתייבש במשך דקה לפני שתוציאו את הספייסרים ותפרקו בעדינות את המגלשות. כרית האגר תידבק לאחד מהם.
4. פיפטה ~ 10 μl הרדמה (2 mM levamisole ב M9 חיץ) כדי לרפד ולהעביר ~ 10 בעלי חיים באמצעות פיק חוט פלטינה. כסו בכיסוי (~ 22 x 22 מ"מ) וצלמו תמונות תוך שעה.
5. לחלופין, כדי לרכוש סרטים על פני תקופה ארוכה יותר של זמן או כדי להפחית עוד יותר את האפשרות של כל תנועה של בעלי החיים, להשתמש בשילוב של הרדמה ו immobilization חרוזים.
   1. הכינו רפידות אגרוז 10% (בחיץ M9) כמתואר והוסיפו תולעים לתמיסת תקני גודל ננוספירה של 3 μl (חרוזי פוליסטירן, 100 ננומטר) בתוספת 3 μl חומר הרדמה (4 mM levamisole בחיץ M9). יש לכסות בעדינות בכיסוי אחיד. כדי למנוע התייבשות, אטמו את הכיסוי עם VALAP (תערובת של כמויות שוות של וזלין, לנולין ושעוות פרפין).
6. תמונה תולעים משותקות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.
   הערה: התוצאות מתקבלות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי מסוג Spinning Disc AF המצויד במצלמת EM-CCD ותוכנה לאוטומציה וניתוח תמונה של מיקרוסקופיה כגון MetaMorph מתארים את הפרטים הבאים, אך ניתן להשתמש גם במערכות הדמיה קונפוקלית דומות אחרות.
   1. השתמש במטרה 63X או 100X/1.4NA שמן ומקם את שקופית המיקרוסקופ המכילה תולעים לתוך מחזיק שקופיות המיקרוסקופ.
   2. פתח את התוכנה. התאם את עוצמת הלייזר והמסננים להדמיית mRFP. השתמש בלייזר 561 ננומטר בהספק של 10% ובמסנן פליטה >600 ננומטר.
   3. פתח את "רכישה רב מימדית". תחת הכרטיסייה "ראשי", סמן את התיבות עבור "Timelapse" ו- "הפעל יומנים" (מיקוד אוטומטי של חומרה: כבוי).
   4. תחת הכרטיסייה "שמירה", בחר או צור את תיקיית הספרייה שבה יש לשמור את הקבצים. הקצה שם לקובץ.
   5. תחת הכרטיסייה "אורך גל", בחר את התאורה המתאימה והתאם את החשיפה והרווח. השתמש ב- "YokoQuad Red" (או הגדרת תאורה מקבילה להדמיית mRFP) עם חשיפה בין 100 ל- 300 msec ורווח מצלמה בין 100 ל- 300, בהתאם לדגימה הבודדת (המוערכת באמצעות התמונה החיה).
   6. תחת הכרטיסייה "קיטועי זמן", בחר "מספר נקודות זמן" = 301, "משך" = 5 דקות ו"זמן/מרווח" = 1 שניות.
   7. תחת הכרטיסייה "יומנים", בחר יומן: "AFC SET Z HOLD" ו- "AFC Return to Z HOLD", הקלד: "מיוחד" (פעמיים), נקודה ראשונית: "נקודת התחלה של זמן" ו- "נקודת סיום זמן". אפשרות מיקוד אוטומטי זו חשובה כדי לצלם את אותו מקטע לאורך פרק זמן ארוך יותר.
   8. לאחר השלמת ההתקנה, לחץ על "רכישה". סרטון קיטועי הזמן נשמר כקבצי TIFF נפרדים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מגיב
תקני גודל ננוספירה 100 ננומטר	תרמוסיינטיפיק	3100א
לבאמיסולה	סיגמא	L-9756
ציוד
Sorvall Legend XTR צנטריפוגה בקירור, 120VAC	תרמוסיינטיפיק	75004521	http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 VAC/EW-17707-60
משכפל 96 פינים	סקיונומיקס		http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro שייקר הדגירה בעל קיבולת גבוהה	דיגילאב		http://www.digilabglobal.com/higro
מתקן מגיב קומבי Multidrop	טיטרטרק		http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
תחנת עבודה אוטומטית Biomek FX AP96	בקמן קולטר		http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
שייקר Innova44	ניו ברנזוויק		http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04&פעולה=מוצרים&contentid=1& catalognode=83389
M205 FA	לייקה		http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigital מצלמת CCD	האמאמאטסו		http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
דיסק מסתובב AF מיקרוסקופ קונפוקלי	לייקה		http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
מצלמת Falcon 4M60	טלדיין דלסה		http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
תוכנה
תוכנת MetaMorph לאוטומציה של מיקרוסקופיה וניתוח תמונות	התקנים מולקולריים		http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI תוכנה לניתוח תמונה	מאייר אינסטרומנטס		http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ	NIH		http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
תוסף wrMTrck עבור ImageJ			http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
זני C. elegans
N2 (WT)	המרכז לגנטיקה Caenorhabditis (CGC)		http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570